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Ziel der Arbeit war die Herstellung der pharmakologisch aktiven Komponenten von Bromelain in Form von rekombinanten Proteinen. Mit den bisher angewendeten Trennmethoden ist es jedoch nicht möglich, einzelne Proteine aus dem Gemisch zu isolierten und daher die pharmakologische Wirkung einer Fraktion auf ein Protein zurückzuführen. Die Arbeit beschäftigte sich daher mit der rekombinanten Herstellung von Cysteinproteasen, die die Hauptbestandteile biochemisch und pharmakologisch charakterisierter Fraktionen bilden. Gene von Vertretern aus der Gruppe der Stamm- und Fruchtbromelaine, sowie Ananain wurden aus einer hergestellten cDNA-Bank des Ananasstammes isoliert, wobei eine neue Stammbromelainsequenz entdeckt wurde. Durch Modifikation des Expressionskonstruktes und Optimierung der Expressionsbedingungen konnte die Ausbeute von 1 mg/ml auf 12,5 mg/l aktives Protein gesteigert werden. Es muss weiterhin in Betracht gezogen werden, dass an der pharmakologischen Wirkung der Fraktion auch andere Proteine als die Cysteinproteasen beteiligt sein könnten, da einige pharmakologische Wirkungen eindeutig nicht auf die Cysteinproteasen zurückzuführen sind. Als Kandidat für ein solches Protein wurde der Bromelaininhibitor vorgeschlagen und exprimiert. Erstmalig besteht so die Möglichkeit, die Wechselwirkungen der Inhibitoren und der Proteasen zu untersuchen. Die rekombinant hergestellten Proteine bilden die Grundlage für pharmakologische Tests zur Aufklärung des Wirkmechanismus von Bromelain, sowie der Resorption intakter Protein vom Darm in das Blut und eventuell zum therapeutischen Nutzen der Proteine. There is significant interest in understanding the mode-of-action of bromelain, an extract of pineapple (Ananas comosum) used to treat a variety of medical conditions. On the basis of biochemical characterisation of fractionated extracts, cysteine proteases were identified as likely candidates for the active proteins. However, attempts to separate single protein components from native fruit extracts using various chromatographic methods, were not successful. Thus, the specific protease composition of bromelain remained unknown. We aimed, therefore, to produce the active components of bromelain in recombinant form, in order to try to elucidate the basis for its pharmacological activity. To this end, genes encoding for known cysteine proteases in pineapple, including stem bromelain, fruit bromelain, and ananain were isolated from a cDNA-library constructed from pineapple stem. By modification of the expression constructs and optimisation of expression conditions, yield of ananain was increased from 1 mg/l to 12.5 mg/l of active protein. In addition to the known proteases, bromelain inhibitors were also considered as candidates for the pharmacologically active agents as some of the effects do not correlate to protease activity. To investigate this proposal, the pre-protein and isoform BI-III were expressed heterologously. The successful heterologous expression of multiple components of bromelain sets the stage for future experiments to clarify the molecular details of its mode-of-action, as well as investigations into the protein-protein interactions between the proteases and their inhibitors. |
