Kurze Promotoren und Translationskontrollelemente steuern die Expression von Don Juan, Don Juan-Like und Min, wobei Don Juan und Don Juan-Like vermutlich funktionell redundant in der Spermiogenese von Drosophila melanogaster sind

Autor: Hempel, Leonie
Přispěvatelé: Renkawitz-Pohl, Renate (Prof. Dr.)
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2004
Předmět:
DOI: 10.17192/z2004.0152
Popis: Das testisspezifisch exprimierte Gen don juan (dj), sowie die in dieser Arbeit neu charakterisierten Gene don juan-like (dj-like) und min sind als Cluster auf dem 3. Chromosom organisiert. Ihre Expression erfolgt translationskontrolliert, d.h die Transkripte der Gene sind bereits in prämeiotischen Stadien vorhanden, aber das Protein wird erst in postmeiotischen Zellstadien translatiert. Das Don Juan-Protein kolokalisiert mit dem Chromatin während der Kern-Transformation und ist entlang der Flagellen elongierter Spermatiden detektierbar. Subzellulär ist das DJ-Protein in den mitochondriellen Derivaten und im Kern lokalisiert. Das benachbarte Gen dj-like zeigt Identität zu don juan, 70 % auf Nukleotidebene und 42 % auf Proteinebene. Da eine Beteiligung der drei Genprodukte an dem postmeiotischen Differenzierungsprozess der Spermatogenese wahrscheinlich ist, erscheint neben einer Analyse der don juan-, dj-like- und min-Genregulation eine Funktionsanalyse der kodierten Proteine sinnvoll. Die transgene Expression eines Myc-DJ-Like-Fusionsproteins in der männlichen Keimbahn unter genregulatorischer Kontrolle des dj-like Promotors ermöglichte die spezifische Lokalisierung des Fusionsproteins in den Flagellen elongierter Spermatiden sowie in den Spermatidkernen während der Chromatinkondensationsphase. Unter Verwendung von Promotor-Reportergenkonstrukten konnte im transgenen Organismus gezeigt werden, dass die Expression von dj-like und min ebenso wie von don juan von kurzen genvorgelagerten Sequenzen gesteuert wird. Während 200 bp stromaufwärts des Translationsstarts von min zur Expressionsregulation des min-Gens ausreichen, sind für die Regulation der Expression von dj-like 650 bp stromaufwärts des Translationsstarts ausreichend. Zudem konnte die für die Repression der dj-mRNA verantwortliche Region auf 35 bp direkt stromaufwärts des ATG in der 5 UTR des Gens eingegrenzt werden. In dem Leaderbereich des min-Gens wurde ebenfalls direkt stromaufwärts des ATG eine 30 bp umfassende Region identifiziert, welche die Translationskontrolle der min-mRNA vermittelt. Sequenzidentitäten beider Regionen von dj und min sind nicht vorhanden. Mit Hilfe eines kreuzungsgenetischen Experimentationsansatzes wurde festgestellt, dass das Boule Protein in die Translationskontrolle von min involviert ist und Einfluss auf die Expressionshöhe des Proteins hat. Eine transkriptionsreprimierende Funktion der Proteine DJ und DJ-Like wurde durch ektopische Expression der Fusionsproteine Myc-DJ und Myc-DJ-Like in Augenimaginalscheiben und daraus resultierenden Entwicklungsdefekten nahegelegt. Zur Klärung der Funktion von DJ, DJ-Like und Min sollte eine Ethylmethansulfonat (EMS)-Mutagenese dienen. Als Selektionskriterium wurde hierbei ein bei Mutation männlich steriler dj-, dj-like- und min-Phänotyp postuliert. Zwei mit EMS-mutagenisierte Fliegenlinien zeigten gegenüber einer dj-, dj-like- und min-defizienten Fliegenlinie einen männlich sterilen, bzw semisterilen Phänotyp. Nach einer molekularbiologischen Analyse der beiden potentiell dj-, dj-like- und min-mutanten Fliegenlinien konnte eine Mutation in allen drei Genen ausgeschlossen werden. Alternativ wurde mit Hilfe der RNAi-Technik das don juan-Gen posttranskriptional ausgeschaltet. Das Gene-Silencing von don juan hatte keinen Phänotyp zur Folge. Eine funktionelle Redundanz der Proteine DJ und DJ-Like ist daher wahrscheinlich.
The testis spcifically expressed gene don juan (dj) and the newly characterised genes don juan-like (dj-like) and min are a cluster on the 3. chromosome of Drosophila melanogaster. The expression of the genes is translationally controlled. The transcripts are expressed premeiotically but the protein is translated in postmeiotic cells only. The Don Juan protein can be detected in mitochondrial derivatives and in the nuclei. don juan and the adjacent gene dj-like are 70 % identical at the nucleotide level and 42 % identical on protein level. It is supposed that the proteins Don juan, Don Juan-Like and Min are involved in the postmeiotic differentiation process of the sperms. Hence an analysis of the don juan-, don juan-like- and min-generegulation and also a functional analysis of the encoded proteins is reasonable. The Myc-DJ-Like fusionprotein was transgenetically expressed in the male germline under the control of the dj-like promoter. By this the fusionprotein could be specifically localized in the flagella of elongated spermatids and in the spermatidnuclei during chromatincondensation. Testing promoter-reportergene-constructs in transgenic flies it was revealed that the expression of don juan-like and min is regulated by short sequences. While only 200 bp upstream of the translation start codon of min are sufficient for the regulation of the min gene, 650 bp upstream of the translation start codon of don juan-like are sufficient for the expression of the gene dj-like. The region mediating the translational repression of the don juan-mRNA was restricted to 35 bp upstream of the ATG in the Leader of the gene. Also 30 bp in the leader of min upstream of the ATG mediate translational repression of min-mRNA. Both translational control regions show no sequence identities. Expression level of the Min protein depends on Boule and the protein Boule is involved in the translational control of the min-mRNA. The ectopic expression of the fusionproteins Myc-DJ and Myc-DJ-Like in eye imaginaldiscs leads to a reduced eye phenotype suggesting a transcriptional repression function. To reveal the function of DJ, DJ-Like and Min a Ethylmethansulfonat (EMS)-mutagenesis was performed. A male sterile dj-, dj-like and min-phenotype was postulated. Two mutagenised flylines showed a male sterile and a semisterile phenotype respectively over a dj-, dj-like and min deficient flyline. A molecular biological analysis of both flylines showed that there are no mutations in these three genes. Using RNAi-technique the don juan gene was silenced posttranscriptionally resulting in no phenotype. So, Don Juan and Don juan-like could be functionally redundant.
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: