Nitrogenase-ähnliche Biosynthese von (Bakterio)chlorophyllen

Autor: Jasper, Jan
Přispěvatelé: Jahn, Dieter, Layer, Gunhild
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2021
Předmět:
Popis: The class of nitrogenase-like enzymes consists of a homodimeric reductase subcomplex and a heterotetrameric catalytic subcomplex. Here, the formation of heterologous and chimeric enzymes, combining subcomplexes of nitrogenase, chlorophyllide a oxidoreductase (COR), dark-operative protochlorophyllide oxidoreductase (DPOR) (both from bacteriochlorophyll biosynthesis) and Ni2+-sirohydrochlorin a,c-diamide reductase (CfbCD, from cofactor F430 biosynthesis) was functionally analyzed. First, the COR enzymes from Heliobacterium modesticaldum and Rhodopseudomonas palustris were recombinantly produced and biochemically characterized. Spectroscopic and bioinformatic analyses indicated the presence of two [4Fe-4S] clusters. The pigments produced by COR from H. modesticaldum and from R. palustris revealed a distinct UV-Vis spectrum in activity assays, supporting the proposed alternative 8-vinyl reductase activity of COR from H. modesticaldum. A heterologous COR enzyme consisting of subcomplexes (BchX)2 from Roseobacter denitrificans and (BchYZ)2 from R. palustris was enzymatically active. The second part of this study investigated the formation of chimeric complexes of various reductases with the nitrogenase MoFe protein from Azotobacter vinelandii. Gel filtration experiments indicated the formation of a chimeric, nitrogenase-like (ChlL)2MoFe(ChlL)2 complex between MoFe and DPOR reductase (ChlL)2 from Prochlorococcus marinus. On-column interaction-assays and initial microscale thermophoresis experiments suggested that the chimeric interaction between MoFe and (ChlL)2 is stronger than the inter-subcomplex interaction in the homologous DPOR system. An investigation of the nucleotide-dependent association and dissociation of the chimeric complex revealed no significant modulation of the binding affinity in the presence of the (ChlL)2 wild-type protein and various nucleotides. However, (ChlL)2 variant Y127S showed a dynamic nucleotide-dependent complex formation with MoFe as described for the nitrogenase system. Although no nitrogenase activity was observed, the ATPase activity of (ChlL)2 and (ChlL)2 variant Y127S was triggered upon association with MoFe, indicating an inter-subcomplex crosstalk. The described (ChlL)2 variant Y127S might be an attractive platform for the characterization of the diverse functions of NifH and the future design of a more robust nitrogenase reductase.
Nitrogenase-ähnliche Enzyme bestehen aus einem homodimeren Reduktase Subkomplex und einem heterotetrameren katalytischen Subkomplex. In dieser Arbeit wurde die Bildung von heterologen und chimären Enzymen durch Kombination von Subkomplexen der Nitrogenase, der Chlorophyllid a Oxidoreduktase (COR), der Licht-unabhängigen Protochlorophyllid Oxidoreduktase (DPOR) (beide aus der Bakteriochlorophyll Biosynthese) und der Ni2+-Sirohydrochlorin a,c-Diamid Reduktase (CfbCD, aus der Cofaktor F430 Biosynthese) funktionell analysiert. Zunächst wurden die COR Enzyme aus Heliobacterium modesticaldum und Rhodopseudomonas palustris rekombinant hergestellt und biochemisch charakterisiert. Spektroskopische und bioinformatische Analysen wiesen auf die Anwesenheit von zwei [4Fe-4S] Clustern hin. Die von den COR Enzymen aus H. modesticaldum und aus R. palustris produzierten Pigmente zeigten in Aktivitätsassays ein unterschiedliches UV-Vis Spektrum, was die vorgeschlagene alternative 8-Vinylreduktase-Aktivität der COR aus H. modesticaldum belegt. Ein heterologes COR Enzym bestehend aus (BchX)2 aus Roseobacter denitrificans und (BchYZ)2 aus R. palustris war aktiv. Im zweiten Teil wurde die Bildung von chimären Komplexen aus unterschiedlichen Reduktasen und dem MoFe Protein der Nitrogenase aus Azotobacter vinelandii untersucht. Über Gelfiltration wurde die Bildung eines chimären, Nitrogenase-ähnlichen (ChlL)2MoFe(ChlL)2 Komplexes zwischen MoFe und der DPOR Reduktase (ChlL)2 aus Prochlorococcus marinus gezeigt. Interaktions-Assays und erste Thermophorese Experimente (microscale thermophoresis) legten nahe, dass die Interaktion zwischen MoFe und (ChlL)2 stärker ist als die Inter-Subkomplex Interaktion im homologen DPOR System. Eine Untersuchung der nukleotidabhängigen Bildung des chimären Komplexes ergab keine signifikante Modulation der Bindungsaffinität in Gegenwart des (ChlL)2 Wildtyp Proteins und verschiedener Nukleotide. Die (ChlL)2 Variante Y127S zeigte jedoch vergleichbar zum Nitrogenase-System eine nukleotidabhängige Komplexbildung mit MoFe. Obwohl keine Nitrogenase-Aktivität beobachtet wurde, zeigten (ChlL)2 und die (ChlL)2 Variante Y127S bei Assoziation mit MoFe eine deutliche Erhöhung der ATPase Aktivität, was auf einen Inter-Subkomplex „Crosstalk“ hinweist. Die beschriebene (ChlL)2 Variante Y127S ist ein interessanter Ausgangspunkt für die Charakterisierung der vielfältigen Funktionen von NifH und das zukünftige Design einer robusteren Nitrogenase Reduktase.
Databáze: OpenAIRE
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