Thermodynamic, Kinetic and Crystallographic Investigations of Benzenesulfonamides as Ligands of Human Carbonic Anhydrase II

Autor: Glöckner, Steffen, Klebe, Gerhard Prof. Dr.
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2020
Předmět:
DOI: 10.17192/z2020.0123
Popis: Die hierin vorgestellten Daten zeigen, dass verschiedene Geometrien eines para-Alkylsubstituenten eines Benzolsulfonamidgerüsts einen deutlichen Einfluss auf die thermodynamischen und kinetischen Bindungsparameter haben können und deuten darauf hin, dass die Feinabstimmung der Komplementarität der Molekülgeometrie des Liganden auf die des aktiven Zentrums des Proteins zu einer verlangsamten Dissoziationskinetik des Protein-Ligand Komplexes und somit zu einer längeren Blockade des aktiven Zentrums führen kann. Zusätzlich wurde festgestellt, dass die mit isothermer Titrationskalorimetrie extrahierten kinetischen Daten mit Daten aus Experimenten mit Oberflächenplasmonenresonanz für eine Teilmenge von Verbindungen korrelieren, trotz eines bisher nicht zu erklärenden Unterschieds von einer Größenordnung. Darüber hinaus zeigte die Untersuchung von fluorierten Benzolsulfonamidliganden komplexe strukturthermodynamische und strukturkinetische Beziehungen, die hierin nicht vollständig aufgeklärt werden konnten, aber darauf hindeuten, dass die selektive Fluorierung einer meta-Position des aromatischen Rings hohe Assoziations- als auch niedrige Dissoziationsraten begünstigt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass hochgradiger fluorierte Analoga nicht notwendigerweise einen Vorteil für das thermodynamische oder kinetische Bindungsprofil oder die Affinität selbst haben. Darüber hinaus deuten strukturell ähnliche Liganden mit nur einem para-Substituenten, aber unterschiedlichen Aciditäten darauf hin, dass eine erhöhte Acidität des Liganden erhöhte Assoziationsraten begünstigt. Ein neues Messprotokoll für mikrokalorimetrische Messungen wurde auf seine Präzision hin analysiert und mit anderen möglichen Messprotokollen verglichen und zeigte, dass es sich am besten für die zuverlässige gleichzeitige Ermittlung von thermodynamischen und kinetischen Daten mittels Mikrokalorimetrie eignet. Die mikrokalorimetrische Untersuchung eines bereits bekannten und vermeintlich sehr potenten Carboanhydraseinhibitors zeigte ein unerwartetes zweistufiges Bindungsverhalten, das eine reine 2 : 1 Bindung von Inhibitor und Protein jedoch ausschließt. Zeitabhängige Experimente lassen den Schluss zu, dass der Bindungsvorgang zwischen Protein und Ligand zu einem thermodynamisch und einem kinetisch bevorzugten Komplex führt. Die Untersuchung eines chiralen heterocyclischen Carboanhydraseinhibitors konnte nicht abschließend klären, ob auch das kristallografisch scheinbar nicht bindende Enantiomer auch inhibitorische Wirkung zeigt. Mikrokalorimetrische Untersuchungen weisen jedoch darauf hin, dass unter den experimentellen Bedingungen Racemisierung Auftritt, was die Klärung der ursprünglichen Frage deutlich erschwert. Das Tränken von Carboanhydrasekristallen in Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen eines Liganden zeigte, dass die Besetzung einer zweiten Bindestelle zu schwach war, um kristallographisch modelliert zu werden, was die angestrebte Untersuchung der Konzentrationsabhängigkeit der Besetzung unmöglich machte. Konzentrationsunterschiede sorgten jedoch für unterschiedliche Besetzungen des aktiven Zentrums. Ein kristallografisches Modell, das auf Neutronenbeugungsdaten der humanen Carboanhydrase II im Komplex mit Saccharin basiert, wurde nicht erhalten. Es wurde jedoch versucht, den Protonierungszustand von Saccharin an der aktiven Stelle des Enzyms mit Hilfe von hochaufgelösten Röntgenbeugungsdaten durch experimentelle Phasierung zu beurteilen. Die Fortsetzung eines Fragment-Screenings zeigte die Bindung weiterer Kleinmoleküle in Carboanhydrasekristallen. Eine Analyse mit dem Pan-Dataset Density Analysis Programm lässt darauf schließen, dass Elektronendichtekarten stark von der Zeit der Tränkung des Kristalls abhängig sind.
The data presented here show that different geometries of para-alkyl substituents of a benzenesulfonamide scaffold can have a significant influence on the thermodynamic and kinetic binding parameters and suggest, that the fine-tuning of the ligand geometry to match the geometry of the active site leads to a reduced dissociation rate of the protein-ligand complex and thus to a prolonged binding in the active site. In addition, it was found that the kinetic data extracted by isothermal titration calorimetry correlate with data from experiments with surface plasmon resonance for a subset of compounds, despite a difference of one order of magnitude that could not be explained so far. Furthermore, the investigation of fluorinated benzenesulfonamide ligands revealed complex structural-thermodynamic and structural-kinetic relationships, which could not be fully elucidated herein, but suggest that fluorination of a meta-position of the aromatic part of the benzenesulfonamide backbone favors high association as well as small dissociation rates. In addition, it has been shown that a higher degree of fluorination does not necessarily have an advantage for the thermodynamic or kinetic binding profile or affnity itself. Furthermore, structurally similar ligands with only one para-substituent but different acidities indicate that the association rate of complex formation benefits from increased acidity. A new measurement protocol for microcalorimetric measurements was analyzed for its precision and compared with other possible measurement protocols and showed that it is best suited for the reliable simultaneous determination of thermodynamic and kinetic data by microcalorimetry. The microcalorimetric investigation of an already known and supposedly very potent Carbonic Anhydrase inhibitor showed an unexpected two-step binding behavior, which, however, excludes a 2 : 1 binding of inhibitor and protein. Time-dependent experiments suggest that the binding process between protein and ligand leads to a thermodynamically and kinetically preferred complex. The investigation of a chiral heterocyclic Carbonic Anhydrase inhibitor could not conclusively clarify, whether the crystallographically apparently non-binding enantiomer also shows inhibitory activity. However, microcalorimetric investigations allow the conclusion that racemization occurs under experimental conditions, which makes the clarification of the original question considerably more difficult. Soaking of Carbonic Anhydrase crystals in solutions of different concentrations of a ligand showed, that the occupancy of a second binding site was too weak to allow modeling of the ligand, which made it impossible to investigate the concentration dependence of the occupancy in this binding site. Concentration differences, however, resulted in different occupancies of the active site. A crystallographic model based on neutron diffraction data of human Carbonic Anhydrase II in complex with saccharin was not obtained. However, an attempt was made to assess the protonation state of saccharin in the active site of the enzyme by experimental phasing using high-resolution X-ray diffraction data. The continuation of a fragment screening showed the binding of further small molecules in Carbonic Anhydrase crystals. An analysis with the Pan-Dataset Density Analysis program suggests, that electron density maps are strongly dependent on the time of soaking of the crystals.
Databáze: OpenAIRE
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