Untersuchungen zu Mechanismen der Co-Internalisierung von Arrestin-3 mit GPCRs

Autor:	Mößlein, Nadja
Přispěvatelé:	Bünemann, Moritz (Prof. Dr.)
Jazyk:	němčina
Rok vydání:	2021
Předmět:	Pharmakologie Arrestin Ubiquitinierung G-Protein gekoppelte Rezeptoren GPCR internalization Rezeptorinternalisierung Fluorescence Recovery After Photobleaching Förster Resonanz Energie Transfer FRET mArrestin trafficking FRAP Biowissenschaften Biologie GPCR Life sciences ddc:570
Popis:	Arrestine sind eine kleine Familie von vier Proteinen, die eine wichtige Rolle in der Signaltransduktion von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) spielen. Neben ihrer Funktion in der Desensibilisierung des G-Protein-Signalwegs sind sie auch für die Internalisierung aktivierter GPCRs zuständig. Je nachdem, ob Arrestin dabei am Rezeptor gebunden bleibt oder abdissoziiert, werden GPCRs in zwei Klassen eingeteilt. Klasse-A-Rezeptoren wie der b2AR werden nach einer transienten Interaktion mit Arrestin alleine in Endosomen transportiert, wohingegen Klasse-B-Rezeptoren wie der AT1R oder PTHR stabile Komplexe mit Arrestinen bilden und gemeinsam ins Zellinnere co-internalisieren. Die Ursache für das unterschiedliche Internalisierungsverhalten verschiedener Rezeptoren mit Arrestinen ist bisher nicht abschließend erforscht und wurde daher in dieser Arbeit näher untersucht. Bislang wird in diesem Zusammenhang vermutet, dass eine langanhaltende Ubiquitinierung des Arrestins, die nur durch Klasse-B-Rezeptoren induziert wird, für die Co-Internalisierung von Arrestin entscheidend ist. Deshalb war es im ersten Teil dieser Arbeit das Ziel, die Co-Internalisierung des Arrestins mit Klasse-B-Rezeptoren durch die Elimination von Lysinresten, an die Ubiquitin üblicherweise geknüpft wird, zu verhindern. Den Lysinen 11 und 12 in Arrestin-3 wird bisher eine wichtige Rolle für die Internalisierung von Arrestin zugeschrieben, da deren Austausch durch Arginine (KK11RR) dazu führt, dass diese Doppelmutante nicht mehr mit dem AT1R in die Zelle internalisiert (Shenoy und Lefkowitz, 2005). Außerdem interagiert sie nur noch transient mit weiteren Klasse-B-Rezeptoren (Zindel, 2015). Da Docking-Untersuchungen jedoch zeigen konnten, dass die eingefügten Arginine durch intramolekulare Wechselwirkungen die inaktive Konformation von Arrestin stabilisieren, wurde versucht, diesen Effekt der KK11RR-Mutation durch das zusätzliche Einfügen destabilisierender Mutationen umzukehren. Dafür wurden einerseits die Interaktionspartner der Arginine zu Alaninen mutiert (ED389AA) und zum anderen die Mutation R170E eingefügt, die Arrestin-3 in eine präaktivierte Konformation bringt (Granzin et al., 2015). Tatsächlich konnte durch die Kombination von KK11RR mit diesen Mutationen erreicht werden, dass diese Arrestin-Mutanten wieder stabile Komplexe mit Klasse-B-Rezeptoren bilden und mit gemeinsam diesen internalisert werden. Außerdem zeigten sowohl Arr3 KK11RR R170E als auch Arr3 KK11RR ED389AA nach der Stimulation des PTHR eine für Klasse-B-Rezeptoren typische stabile Ubiquitinierung, die in ihrem Ausmaß der von Wildtyp-Arrestin entsprach. Somit konnte bestätigt werden, dass Arr3 KK11RR nach dem Einfügen zusätzlicher destabilisierender Mutationen wieder mit Klasse-B-Rezeptoren co-internalisiert und die beiden Lysine 11 und 12 dafür nicht zwingend als Ubiquitinierungsstellen zur Verfügung stehen müssen. Da Arrestin-3 nach der vollständigen Elimination aller potenziellen Ubiquitinierungsstellen durch Austausch aller Lysine durch Arginine kaum noch an GPCRs binden konnte, wurden im nächsten Teil der Arbeit stattdessen nur einzelne nachgewiesene Ubiquitinierungsstellen aus Arrestin-3 entfernt, die durch eine massenspektrometrische Untersuchung und Literaturrecherche identifiziert wurden. Da jedoch alle acht Arrestin-Einzelmutanten weiterhin mit dem PTHR co-internalisierten, wurden als nächstes alle Lysin-zu-Arginin-Mutationen in einem Arrestin vereint. Diese Mehrfachmutante zeigte mit dem PTHR ein sehr variables Internalisierungsverhalten und colokalisierte mit dem Rezeptor nur in manchen Zellen, während der Rezeptor in anderen Zellen alleine in Endosomen aufgenommen wurde. Da der Grund für diesen uneinheitliche Phänotyp nicht geklärt werden konnte, wurde die Anzahl der Mutationen daraufhin schrittweise reduziert, um herauszufinden, welche der Punktmutationen für eine reduzierte Co-Internalisierung der Arrestin-Mutante mindestens kombiniert werden müssen. Dies führte auch zu einem weniger variablen Internalisierungsverhalten mit Klasse-B-Rezeptoren. Letztendlich konnten die relevanten Mutationen auf die Lysine 108 und 178 in Arrestin-3 eingegrenzt werden, da die Arrestin-Doppelmutante Arr3 K108R K178R mit mehreren untersuchten Klasse-B-Rezeptoren nicht mehr in die Zelle aufgenommen wurde. Trotzdem wurde in FRAP-Messungen (Fluorescence recovery after photobleaching) festgestellt, dass Arr K108R K178R mit einem aktivierten Klasse-B-Rezeptor genauso langlebige Komplexe bildet wie Wildtyp-Arrestin, was somit bedeutet, dass die reduzierte Co-Internalisierung von Arr3 K178R K108R nicht auf einer weniger stabilen Bindung der Mutante am Rezeptor beruht. Inwiefern stattdessen tatsächlich die reduzierte Ubiquitinierung von Arr3 K178R K108R verantwortlich ist, konnte in dieser Arbeit jedoch nicht abschließend geklärt werden. Um zu überprüfen, welche Bedeutung posttranslationale Modifikationen für die Co-Internalisierung von Arrestinen mit Klasse-B-Rezeptoren haben, wurde zunächst durch den Inhibitor TAK-243, der die wichtigste E1-Ligase Uba1 hemmt, der Großteil der zellulären Ubiquitinierung blockiert. Die Internalisierung von Arrestin-3 wurde zwar durch die Applikation von TAK-243 nicht beeinträchtigt, jedoch ist nicht gesichert, dass die Ubiquitinierung von Arrestin-3 durch den Inhibitor tatsächlich verhindert wird. Durch den SUMOylierungs-Inhibitor 2-D08 wurde die Co-Internalisierung des Arrestins ebenfalls nicht verhindert, sodass die Ubiquitinierung und SUMOYlierung nach den Ergebnissen dieser Arbeit vermutlich nicht entscheidend für die Internalisierung von Arrestin-3 sind. Im letzten Teil der Arbeit wurde mithilfe verschiedener Agonisten des µOR mit unterschiedlichen Bindungshalbwertszeiten untersucht, ob Liganden, die besonders lange am Rezeptor gebunden bleiben, auch eine stabilere Bindung des Arrestins induzieren. Anhand von FRAP-Experimenten wurde jedoch festgestellt, dass die Austauschrate des Arrestins am µOR durch die unterschiedliche Bindungsdauer der einzelnen Agonisten nicht verändert wurde. Außerdem führten Agonisten mit besonders langer Bindungsdauer weder am µOR noch am b2AR dazu, dass Arrestin mit den Klasse-A-Rezeptoren in die Zelle internalisierte. Daraus kann abgeleitet werden, dass die Affinität von Rezeptoragonisten das Klasse-A oder Klasse-B-Verhalten eines Rezeptors nicht verändert und daher keinen Einfluss auf die Co-Internalisierung von Arrestin hat. Arrestins are a small family of four proteins that play an important role in the signal transduction of G protein-coupled receptors (GPCRs). Besides desensitizing the G protein signaling, they also induce the internalization of GPCRs. Based on the apparent stability of arrestin-receptor complexes, GPCRs are classified into two groups. Class A receptors such as the b2 adrenergic receptor (b2AR) interact only transiently with arrestins and arrestin dissociates during the endocytic process, whereas class B receptors like the angiotensin type 1 (AT1R), or parathyroid hormone receptor (PTHR) form very stable complexes with arrestins that co-internalize into endosomes. However, the underlying mechanisms explaining why arrestins only co-internalize with class B receptors are still largely unknown and were therefore examined in more detail in this thesis. The most prominent hypothesis to date is that class B receptors induce sustained ubiquitination of arrestin, which is necessary for the co-internalization of arrestin-receptor complexes. Therefore, in the first part of this thesis, several lysine residues of arrestin-3, which usually serve as acceptors for ubiquitin, were eliminated to prevent the co-internalization with class B receptors. So far it is thought that the ubiquitination of the lysine residues 11 and 12 is necessary to induce the internalization of arrestin-3, as mutation of these lysines to arginines prevents the co-internalization of the arrestin-mutant with the AT1R (Shenoy and Lefkowitz, 2005). In addition, Arr3 KK11RR interacts only transiently with several other class B receptors (Zindel, 2015). However, docking experiments showed that the inserted arginines display stronger intramolecular interactions with the arrestin C-terminus and thereby stabilize its inactive conformation. Therefore, further destabilizing mutations were inserted into Arr3 KK11RR to reverse this effect. On the one hand, the interaction partners of the arginines were mutated to alanines (ED389AA), and on the other hand, the mutation R170E was introduced, leading to a pre- activated conformation of arrestin (Granzin et al., 2015). Indeed, the combination of KK11RR with these rescue mutations led to the formation of stable complexes with class B receptors and their co-internalization. Furthermore, both Arr3 KK11RR R170E and Arr3 KK11RR ED389AA displayed robust and sustained ubiquitination typically observed after stimulation of class B receptors similar to wild-type arrestin-3. Thus, we could confirm that Arr3 KK11RR can internalize with class B receptors after insertion of destabilizing mutations, and the lysine residues 11 and 12 do not have to be available as ubiquitination sites. As the elimination of all potential ubiquitination sites in arrestin-3 by mutation of all lysine residues to arginines resulted in a mutant that showed barely any recruitment to agonist-activated receptors, only proven ubiquitination sites (identified by mass-spectrometry or literature review) were removed. Since eight lysine to arginine single mutants of arrestin-3 still co-internalized with the PTHR, we next combined all of these mutations. The resulting arrestin mutant displayed an inconsistent internalization with the PTHR and colocalized with the receptor only in some cells. As the cause for this variable phenotype could not be identified, the number of mutations in arrestin-3 was next reduced successively to identify those lysine to arginine mutations that influence the co-internalization with class B receptors. This also led to a more consistent co-internalization with these GPCRs. In the end, the relevant mutations could be narrowed down to the lysine residues 108 and 178 as the double mutant Arr3 K108R K178R was no longer co-internalized with several class B receptors. Moreover, FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) measurements showed that the complexes between this mutant and an agonist-activated class B receptor were as stable as with wild-type arrestin-3, suggesting that the reduced co-internalization of Arr3 K108R K178R was not based on a less stable receptor binding. However, the question remains whether the impaired co-internalization can indeed be attributed to the reduced ubiquitination of this arrestin mutant. To examine the role of posttranslational modifications in the co-internalization of arrestin-3 with class B receptors, we first prevented the cellular ubiquitination with an inhibitor of the most prominent E1-ligase Uba1, TAK-243. Even though this did not impair the co-internalization of arrestin with class B receptors, it is not completely sure whether TAK-243 indeed prevents the ubiquitination of arrestin-3. As the SUMOylation inhibitor 2-D08 did not affect the internalization of arrestin-3 either, both ubiquitination and SUMOylation do not play a major role in the co-internalization of arrestin with class B receptors according to this thesis. In the last part of the thesis, several agonists for the µ-opioid receptor (µOR) with different dissociation half-lives were employed to examine whether ligands with particularly slow off-rates also induce the formation of more stable receptor-arrestin complexes. However, FRAP experiments demonstrated that the exchange rate of arrestin-3 at the µOR is not affected by the dissociation half-life of the agonist. Furthermore, agonists with very slow off-rates could not induce co-internalization of arrestin-3 with the class A receptors µOR and b2AR. In conclusion, the dissociation half-lives of agonists do not affect class A or class B behavior of GPCRs and therefore do not influence the co-internalization of arrestins.
Databáze:	OpenAIRE
Externí odkaz:	https://explore.openaire.eu/search/publication?articleId=doi_dedup___::3d3f8322766e9df1d5f47638a6845a12 Zobrazit plný text záznamu