Methotrexate resistance is directly associated with glutathione concentration in acute lymphoblastic leukemia cell lines

Autor: Rafael Renatino Canevarolo
Přispěvatelé: Yunes, José Andrés, 1967, Scrideli, Carlos Alberto, Reis, Rui Manuel Vieira, Saad, Sara Teresinha Olalla, Kobarg, Jörg, Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Rok vydání: 2017
Předmět:
Zdroj: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
Popis: Orientador: José Andrés Yunes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A leucemia linfoide aguda (LLA) é o tipo de câncer mais comum da infância, correspondendo a 25% de todos os casos de câncer nesta faixa etária. Um dos quimioterápicos utilizados na terapia da LLA (e de doenças autoimunes como a artrite reumatoide) é o metotrexato (MTX), um antagonista do ácido fólico (antifolato). O mecanismo de ação do MTX enquanto quimioterápico é primariamente atribuído à inibição da enzima dihidrofato redutase, que sintetiza tetrahidrofolato a partir de dihidrofolato ¿ etapa fundamental na síntese de novo de nucleotídeos purínicos utilizados na divisão celular. Em artrite reumatoide, doses menores de MTX inibem a enzima 5-aminoimidazole-4-ribonucleotídeo-carboxamida formiltransferase (ATIC), o que culmina com a produção de altos níveis de adenosina, um potente anti-inflamatório. No entanto, diversos trabalhos recentes continuam a apresentar mecanismos e efeitos até então desconhecidos por meio dos quais o MTX atua no ambiente celular, atestando que os mecanismos de ação do MTX parecem ser tão múltiplos quanto complexos. Utilizando diversas técnicas de biologia molecular, este trabalho procurou expandir o conhecimento existente da ação do MTX em LLA. Para isso, diversos parâmetros biológicos foram mensurados sob efeito ou não do MTX em um painel de 13 linhagens celulares de LLA. Foram realizados ensaios de proliferação, estudos metabolômicos, de sinergismo com drogas, quantificação da respiração celular e da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), além da medição da ativação da via de sinalização do NF-?B. A resistência das linhagens ao MTX em 48 h de tratamento (mas não em 96 h) mostrou-se relacionada ao tempo de duplicação celular. O tratamento com MTX alterou a concentração de 28 metabólitos intracelulares, com destaque para o consistente aumento da glicina. As concentrações intracelulares de asparagina, guanosina e glutationa ¿ inclusive a expressão de genes da via desta última ¿ se mostraram associadas com a resistência ao MTX. A suplementação do meio de cultura com N-acetilcisteína, um metabólito precursor de glutationa, promoveu proliferação e resistência ao MTX; entretanto, o tratamento das células com piperlongumina ou peróxido de hidrogênio, dois sequestradores de glutationa e promotores de ROS, não potencializou o efeito do MTX. O MTX induziu pequenas quantidades de ROS nas linhagens de LLA. Após 1 h com a droga, as células mais sensíveis ao antifolato produziram mais ROS que as mais resistentes; em 3 h essa dinâmica se inverteu e assim permaneceu até as 6 h. O consumo de oxigênio das linhagens não se mostrou associado com a resistência ao MTX e um teste preliminar mostrou que o MTX não alterou a respiração celular. O MTX ativou o fator de transcrição NF-?B em algumas linhagens de LLA e, curiosamente, a ativação deste fator de transcrição pelo fator de necrose tumoral alfa (TNF-?) mostrou-se positivamente correlacionada com a resistência das linhagens leucêmicas ao MTX. Uma vasta revisão bibliográfica permitiu tanto a integração dos resultados obtidos ao conhecimento mais atual sobre o assunto, quanto o apontamento de novos caminhos a serem explorados em etapas futuras Abstract: Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common type of childhood cancer, accounting for 25% of all cancers in this age group. One of the chemotherapeutics used in the therapy of ALL (and autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis) is methotrexate (MTX), a folic acid antagonist (antifolate). As a chemotherapeutic agent, MTX's mechanism of action is primarily attributed to the inhibition of the dihydrophate reductase enzyme, which synthesizes tetrahydrofolate from dihydrofolate ¿ a key step in the de novo synthesis of purine nucleotides used in cell division. In rheumatoid arthritis, lower doses of MTX inhibit the 5-aminoimidazole-4-ribonucleotide-carboxamide formyltransferase (ATIC) enzyme, which culminates in the production of high levels of adenosine, a potent anti-inflammatory. However, recent works continue to present previously unknown mechanisms and effects through which MTX acts within the cell, attesting that MTX's mechanisms of action appear to be as multiple as complex. Using several techniques of molecular biology, this work sought to expand the existing knowledge of the action of MTX in ALL. For this purpose, several biological parameters were measured under or without MTX treatment in a panel of 13 ALL cell lines. Proliferation tests, metabolic studies, drug synergism, quantification of cellular respiration and the production of reactive oxygen species (ROS) were performed, as well as the measurement of the activation of the NF-?B signaling pathway. Resistance of the MTX strains within 48 h of treatment (but not 96 h) was related to the proliferation rate of the cells. Treatment with MTX altered the concentration of 28 intracellular metabolites, highlights for a consistent increase in glycine concentration. Intracellular concentrations of asparagine, guanosine and glutathione ¿ including the expression of genes from glutathione pathway ¿ were associated with MTX resistance. Supplementation of the culture medium with N-acetylcysteine, a precursor metabolite of glutathione, promoted proliferation and resistance to MTX; however, cell treatment with piperlongumine or hydrogen peroxide, two glutathione scavengers and ROS promoters, did not potentiate the effect of MTX. MTX produced small amounts of ROS in ALL cell lines. In 1 h treatment, MTX most sensitive cells produced more ROS than the most resistant ones; after 3 h this dynamics inverted and thus remained until 6 h. The oxygen uptake of the cell lines was not associated with MTX resistance and a preliminary test showed that MTX did not alter cellular respiration. MTX activated the transcription factor NF-?B in some ALL cell lines and, interestingly, the activation of this transcription factor by tumor necrosis factor alpha (TNF-?) was positively correlated with the resistance of leukemic lines to MTX. A wide bibliographic review allowed both the integration of the obtained results to the most current knowledge on the subject, and the identification of new paths to be explored in future stages Doutorado Genética Médica Doutor em Ciências FAPESP 2012/11952-0
Databáze: OpenAIRE
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