Generierung von 'LYmph Node Derived Antibody Libraries' (LYNDAL) : ein Konzept zur Gewinnung humaner monoklonaler Antikörper mit therapeutischem Potential
| Autor: | Diebolder, Philipp |
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| Přispěvatelé: | Kontermann, Roland E. (Prof. Dr.) |
| Jazyk: | angličtina |
| Rok vydání: | 2014 |
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| Popis: | The development of efficient strategies for generating human monoclonal antibodies with therapeutic potential remains a major challenge in the antibody technology field. In present thesis, an applicable approach has been developed for recovering such antibodies from antigen-encountered, human B cell repertoires. As the source for variable antibody genes, immunoglobulin G (IgG)-derived B cell repertoires from lymph nodes of 20 head and neck cancer patients were employed for cloning individual antibody libraries. Sequence analysis of “Lymph Node Derived Antibody Libraries” (LYNDAL) revealed a naturally occurring distribution pattern of rearranged antibody sequences that represent all known variable gene families and most functional germline sequences. To demonstrate the feasibility of presented approach, test selections against distinct therapeutic targets have been performed including the viral glycoprotein B of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) and human epidermal growth factor receptor (EGFR) being frequently overexpressed in head and neck cancer. Panning of LYNDAL from donors with target-specific IgG serum titers delivered 34 anti-gB-1 and seven anti EGFR single-chain variable fragments (scFvs) with unique sequences. Sequence analysis revealed extensive somatic hypermutation of enriched clones as result of natural affinity maturation. Target specificity was confirmed by binding antiviral scFvs to common glycoprotein B variants from HSV-1 and HSV-2 strains and by binding EGFR specific scFvs to various EGFR-overexpressing cancer cell lines. The majority of analyzed scFvs bound to the targets with nanomolar affinity as determined on recombinant proteins as well as on protein variants in their natural context. Therapeutic potential of LYNDAL antibodies was evaluated by functional in vitro assays testing either the virus neutralizing capacity or the potential for mediating tumor cell growth inhibition. From eight scFvs with HSV-neutralizing capacity, the most potent antibody neutralized 50% HSV-2 at 4.5 nM as dimeric (scFv)2. One of the EGFR-specific antibodies showed auspicious anti-proliferative effects on tumor cells. Using SKOV-3 tumor cells, 50% of the EGF-induced cell growth promoting effect was inhibited at 6.2 nM of bivalent scFv Fc. In conclusion, the LYNDAL approach is useful for recovering fully human antibodies with therapeutic potential and is expected to be extendable to others than the here evaluated targets. Die Entwicklung effizienter Strategien zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper mit therapeutischem Potential bleibt eine große Herausforderung innerhalb der Antikörper Technologiebranche. In der vorliegenden Arbeit wurde eine effektive Methode entwickelt, mit welcher Antikörper aus natürlich immunisierten, humanen B Zell-Repertoires gewonnen werden können. Als Quelle für die variablen Bereiche der Antikörpergene wurden Immunglobulin G (IgG)-abgeleitete B-Zell-Repertoires aus Lymphknoten von 20 Kopf- und Hals-Tumorpatienten entnommen, um daraus individuelle Antikörper-Bibliotheken herzustellen. Eine Sequenzanalyse der LYmph Node Derived Antibody Libraries (LYNDAL) ergab ein natürliches Verteilungsmuster an rearrangierten Antikörpersequenzen, wobei alle humanen Antikörperfamilien und die meisten funktionalen Keimbahnsequenzen identifiziert werden konnten. Um die Effizienz der präsentierten Methode zu demonstrieren, wurden Test-Selektionen gegen unterschiedliche therapeutische Antigene durchgeführt, einschließlich dem viralen Glykoprotein B von Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV-1) und dem humanen Epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR), welcher häufig bei Kopf- und Halstumoren überexprimiert vorliegt. Selektionen mit LYNDAL von Spendern mit Antigen-spezifischen IgG Serum-Titer lieferten insgesamt 34 unterschiedliche anti-gB-1 und sieben anti-EGFR single-chain variable fragments (scFvs). Sequenz-Analysen zeigten, dass die angereicherten Klone zahlreiche somatische Hypermutationen aufwiesen, was auf eine natürliche Affinitätsreifung hindeutet. Die Antigen-Spezifität konnte durch Bindung der antiviralen scFvs an ubiquitäre HSV-1- und HSV-2-Varianten von Glykoprotein B bzw. im Falle der EGFR-spezifischen scFvs anhand von EGFR überexprimierenden Tumorzelllinien nachgewiesen werden. Der Großteil der analysierten scFvs besaß nanomolare Affinitäten gegenüber den Zielantigenen und zwar sowohl zu rekombinanten Protein als auch zu Proteinvarianten im natürlichen, therapeutischen Kontext. Das therapeutische Potential der LYNDAL-Antikörper wurde in In-Vitro-Experimenten überprüft, wobei entweder die virale Neutralisationseffizienz oder das Potential zur Tumorzellwachstums-Inhibition getestet wurde. Von insgesamt acht scFvs mit nachgewiesener HSV-Neutralisation-Kapazität konnte der potenteste Antikörper 50% der HSV-2 Partikel bei einer eingesetzten Konzentration von 4.5 nM als dimeres (scFv)2 neutralisieren. Einer der EGFR-spezifischen Antikörper zeigte vielversprechende anti-proliferative Eigenschaften, wobei der durch EGF-induzierte, wachstumsfördernde Effekt gegenüber SKOV-3 Tumorzellen mit 6.2 nM an bivalentem scFv-Fc halbiert werden konnte. Schlussfolgernd kann gesagt werden, dass die entwickelte Methode hilfreich ist, um vollständig humane Antikörper mit therapeutischem Potential zu generieren. Es wird darüber hinaus erwartet, dass das Konzept verwendet werden kann, um Antikörper gegen bis dato noch nicht untersuchte Antigene zu gewinnen. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
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