Biochemical, biophysical, and thermal properties of alkaline phosphatase from thermophile Thermus sp. NTU-237

Autor: Hoang Chinh Nguyen, Wu, S. P., Su, C. H., Hwang, T. S.
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2017
Předmět:
Zdroj: Biotechnologie, Agronomie, Société et Environnement, Vol 21, Iss 2, Pp 117-126 (2017)
ResearcherID
ISSN: 1780-4507
1370-6233
Popis: Description of the subject. Alkaline phosphatases (APases) are commonly used as nonradioactive markers for detecting specific proteins or DNA targets in clinical medicine and molecular biology. However, their applications in the biotechnology industry require thermostability and storage stability. Our preliminary study revealed that APase from Thermus sp. NTU-237 (TsAPase) is thermostable and exhibits high activity. Therefore, it is desirable to establish the optimal conditions for its application.Objectives. To characterize APase from thermophile Thermus sp. NTU-237 and to evaluate its potential applications.Method. The APase gene of Thermus sp. NTU-237 was cloned and expressed in Escherichia coli. Subsequently, the effects of buffer, glycerol, sodium dodecyl sulfate (SDS), NaCl, and temperature on enzyme activity were studied to establish the optimal conditions for TsAPase assays. In addition, the potential for application of TsAPase was evaluated using the 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium (BCIP/NBT) active staining method.Results. Recombinant TsAPase was identified as having a dimeric structure and a molecular mass of 109 kDa. Sequence alignment analysis of known thermophilic APases with TsAPase and E. coli APase revealed that catalytic and binding residues were highly conserved. This finding suggested that the catalytic mechanism of TsAPase is the same as that of other APases. TsAPase activity was inhibited by glycerol and SDS but enhanced by NaCl and Tris-HCl buffer. The kinetic parameters Km, kcat, and Vmaxwere determined to be 81 µM, 6.08 s-1, and 6.76 U·mg-1, respectively. The optimum temperature of TsAPase was 80 °C, and TsAPase was stable at room temperature for more than 10 days. Moreover, TsAPase could catalyze the dephosphorylation of BCIP and could elicit blue color development by the BCIP/NBT reaction kit at room temperature.Conclusions. These results illustrate that TsAPase has potential for application in medical or basic research.
Propriétés biochimiques, biophysiques et thermiques de la phosphatase alcaline de la souche thermophile Thermus sp. NTU-237Description du sujet. Les phosphatases alcalines (APases) sont fréquemment employées comme marqueurs non radioactifs pour la détection spécifique de protéines ou d’ADN cibles en médecine clinique et en biologie moléculaire. Toutefois, leur application en biotechnologie industrielle nécessite une bonne stabilité tant thermique que de conservation. Nos recherches préliminaires ont montré que l’APase de Thermus sp. NTU-237 (TsAPase) est thermostable et présente une haute activité. Il est donc intéressant d’établir les conditions optimales de son emploi.Objectifs. Caractériser l’APase de la souche thermophile Thermus sp. NTU-237 et évaluer ses potentialités d’application.Méthode. Le gène de l’APase de Thermus sp. NTU-237 a été cloné pour être exprimé dans Escherichia coli. Cela a permis l’étude des effets sur l’activité enzymatique TsAPase, de la température, du tampon, des teneurs en glycérol, en dodécyl sulfate de sodium (SDS) et en NaCl pour cerner les conditions optimales d’essai. De plus, les potentialités d’application des TsAPase ont été investiguées au moyen du substrat chromogène 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro bleu de tétrazolium (BCIP/NBT).Résultats. La TsAPase recombinante fonctionne comme un dimère d’une masse moléculaire de 109 kDa. Les alignements de séquences de la TsAPase avec d’autres APases thermophiles connues et l’APase d’E. coli dénotent une bonne conservation des acides aminés impliqués dans l’activité catalytique et dans des fonctions de liaison à certains résidus. Cette découverte suggère que le mécanisme catalytique des TsAPases est identique à celui d’autres APases. L’activité TsAPase s’est avérée être inhibée par le glycérol et le SDS, alors qu’elle s’est accrue en présence de NaCl et de tampon Tris-HCl. Les paramètres cinétiques Km, kcat, et Vmax ont été établis à 81 µM, 6,08 s-1 et 6,76 U·mg-1, respectivement. La température optimale de la TsAPase était de 80 °C. La TsAPase est stable à température ambiante durant plus de 10 jours. De plus, la TsAPase s’est montrée capable de catalyser la déphosphorylation du BCIP, provoquant par la même occasion le développement à température ambiante de la couleur bleue du substrat transformé. Conclusions. Les résultats rapportés illustrent les potentialités d’utilisation de la TsAPase, que ce soit dans le domaine médical ou en recherche fondamentale.
Databáze: OpenAIRE
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