Die SUMOylierung des Transkriptionsfaktors Sp3 reprimiert die Genexpression durch Rekrutierung Chromatin-modifizierender Enzyme und Ausbildung lokaler heterochromatischer Strukturen

Autor: Stielow, Bastian
Přispěvatelé: Suske, Guntram (Prof. Dr.)
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2009
Předmět:
Popis: Die posttranslationale Modifikation vieler Transkriptionsfaktoren mit dem Ubiquitin-ähnlichen Protein SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) führt oft zur transkriptionellen Repression. Der molekulare Mechanismus, wie die SUMO-Modifikation die Transkription reprimiert, war noch weitgehend unbekannt. Unter Verwendung des SUMOylierten Transkriptionsfaktors Sp3 als Modellsystem wurden in unserer Arbeitsgruppe mit Hilfe eines genomweiten RNA-Interferenz-Screens zahlreiche Proteine identifiziert, die an der SUMO-abhängigen transkriptionellen Repression beteiligt sein könnten. Ausgehend von Primärdaten des Screens wurde in der vorliegenden Arbeit für insgesamt 120 Proteine verifiziert, dass deren Depletion mittels spezifischer doppelsträngiger RNA (dsRNA) die Repression durch SUMOyliertes Sp3 partiell aufhebt. Dagegen wurde die transkriptionelle Aktivität einer SUMOylierungs-defizienten Mutante von Sp3 nicht beeinflusst. Weitere Validierungs-Experimente zeigten, dass das Chromatin-remodellierende Enzym Mi-2, das D. melanogaster Orthologe des C. elegans Proteins MEP-1 sowie das Polycomb Protein Sfmbt direkt als SUMO-abhängige transkriptionelle Korepressoren wirken: (1) Der dsRNA-vermittelte Knockdown dieser Proteine verminderte nicht die SUMOylierung von Sp3. Dies zeigt, dass Mi-2, MEP-1 und Sfmbt nicht die SUMOylierungs-Enzymatik, sondern nach der SUMO-Konjugation den Repressionsmechanismus regulieren. (2) Mi-2, MEP-1 und Sfmbt interagierten direkt mit SUMO und mit SUMO-modifiziertem Sp3 und wurden (3) SUMO-abhängig an einen Sp3-regulierten Promotor rekrutiert. (4) Die Depletion von Mi-2, MEP-1 und Sfmbt führte auch zur Aufhebung der Repression durch den SUMOylierten Transkriptionsfaktor Dorsal. Somit scheinen Mi-2, MEP-1 und Sfmbt Teil eines allgemeinen Repressionskomplexes zu sein, der von DNA-gebundenen SUMO-modifizierten Transkriptionsfaktoren rekrutiert wird. Um die mit der SUMO-abhängigen Repression einhergehenden Veränderungen der Chromatinstruktur im Säugersystem zu analysieren, wurde eine Zelllinie mit einem stabil im Genom integrierten Gal4-abhängigen Reportergen etabliert. Nach Transfektion reprimierten die SUMOylierten Gal4-Fusionsproteine von Sp3 und SF-1 (Steroidogenic Factor 1) die Transkription, während die jeweiligen SUMOylierungs-defizienten Mutanten die Transkription des integrierten Transgens aktivierten. Chromatin Immunpräzipitationen ergaben, dass durch Promotor-gebundene SUMOylierte Transkriptionsfaktoren SUMO-abhängig das Chromatin-remodellierende Enzym Mi-2, die MBT-Domänen-Proteine L3MBTL1 und L3MBTL2, die Histon-Methyltransferasen SETDB1 und SUV4-20H, die zu einer Trimethylierung von H3K9 und H4K20 führen, sowie die heterochromatischen Proteine der HP1-Familie rekrutiert werden. Diese heterochromatischen Proteine und repressiven Histon-Modifikationen waren auch auf dem endogenen Sp3-regulierten murinen Dihydrofolat-Reduktase-Promotor in embryonalen Mausfibroblasten vorhanden. Die Ausbildung der heterochromatischen Strukturen erfolgte auch hier Sp3-SUMO-abhängig; sie waren nur in Gegenwart von SUMOyliertem Wildtyp Sp3 nachzuweisen, nicht jedoch wenn eine SUMOylierungs-defiziente Mutante in Sp3-/-Zellen exprimiert wurde. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass transkriptionell repressorisch wirkende SUMOylierte Transkriptionsfaktoren die Ausbildung einer lokalen repressiven Chromatinstruktur mit typischen Eigenschaften von kompaktiertem Heterochromatin initiieren können, die die DNA für die Komponenten der Transkriptionsmaschinerie unzugänglich macht.
Posttranslational modification of many transcription factors with the small Ubiquitin-like modifier SUMO is associated with transcriptional repression. The molecular mechanisms by which SUMO attachment represses transcription were largely unknown. By a genome-wide RNA interference screen our laboratory has recently identified a number of SUMO-dependent repression components using the SUMOylated transcription factor Sp3 as a paradigm. Based on the primary data of the screen, the involvement of 120 proteins in SUMO-mediated repression was verified. Knockdown of these proteins by specific double-stranded RNAs (dsRNAs) impaired Sp3-SUMO-dependent transcriptional repression, whereas the activity of a SUMOylation-deficient Sp3 mutant was not affected. A number of validation experiments revealed that the ATP-dependent chromatin remodeler Mi-2, the D. melanogaster ortholog of the C. elegans protein MEP-1 and the polycomb protein Sfmbt act as direct SUMO-dependent transcriptional corepressors: (1) Knockdown of these proteins did not impair SUMO conjugation demonstrating that they act downstream of SUMO attachment. (2) Mi-2, MEP-1 and Sfmbt interact with SUMO and SUMO-modified Sp3 and (3) are recruited to promoters in a SUMOylation-dependent manner. (4) Knockdown of Mi-2, MEP-1 and Sfmbt relieved also repression mediated by the SUMO-modified transcription factor Dorsal. These results suggest that Mi-2, MEP-1 and Sfmbt are part of a common repression complex established by DNA-bound SUMO-modified transcription factors. In order to analyze the chromatin changes established by SUMO-modified transcription factors in the mammalian system in detail a cell line with a stably integrated chromatinized Gal4-driven reporter gene was generated. On transfection, SUMOylated transcription factors (Gal4 fusions of wildtype Sp3 or steroidogenic factor 1) repressed transcription whereas the corresponding SUMOylation-deficient mutants activated transcription of the integrated reporter gene. Chromatin-immunoprecipitations revealed that the promoter-bound SUMO-modified transcription factors led to the establishment of local repressive chromatin with characteristics of compacted heterochromatin. SUMO-dependent heterochromatin formation included recruitment of the chromatin remodeler Mi-2, the MBT-domain proteins L3MBTL1 and L3MBTL2 involved in chromatin compaction, the heterochromatin protein HP1, and the histone methyltransferases SETDB1 and SUV4-20H accompanied by the establishment of repressive histone modifications such as H3K9 and H4K20 trimethylation. These heterochromatic proteins and repressive histone modifications were also present at the endogenous Sp3-regulated murine dihydrofolate-reductase promotor in mouse embryonic fibroblasts. The establishment of heterochromatic structures was Sp3-SUMO-dependent because they were found only in the presence of SUMOylated wildtype Sp3 but not in Sp3-/- cells expressing a SUMOylation-deficient Sp3 mutant. These results indicate that SUMOylation of transcription factors plays a crucial role in regulating gene expression by initiating chromatin structure changes that renders DNA inaccessible to the transcription machinery.
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: