Untersuchung einer neuen markierungsfreien Nachweismethode zur Diagnostik von Virusinfektionen

Autor: Staat, Doreen
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2020
Předmět:
Popis: Der schnelle Nachweis von Virusinfektionen ist eine entscheidende Voraussetzung, um eine Diagnose und damit einhergehend eine adäquate Behandlung erkrankter Personen zu gewährleisten. Der „ideale diagnostische Test“ sollte u. a. sensitiv, spezifisch, schnell, robust, einfach in der Probenhandhabung, ohne aufwendige Gerätetechnik sowie kostengünstig sein. Damit wird dessen breite Anwendbarkeit erleichtert und die Möglichkeit eröffnet, den Test ohne ein zentrales Diagnostiklabor, z. B. direkt beim Arzt oder „im Feld“ durchzuführen (Point-of-Care-Test). Nur mittels zuverlässiger Diagnostik lassen sich Patienten effizient behandeln und geeignete Maßnahmen einleiten, um eine Ausbreitung von Infektionskrankheiten zu verhindern. Konventionelle Nachweismethoden zur Diagnostik sind u. a. zeitaufwendig, kostenintensiv, erfordern mehrere Probenbearbeitungsschritte, eine adäquate Laborausstattung oder geschultes Personal, was deren Anwendbarkeit, z.B. auch als Point-of-Care-Test, einschränkt. Eine vielversprechende neue Methode für die Virusdiagnostik und den möglichen Einsatz als Point-of-Care-Test stellt die Single Colour Reflectometry (SCORE)-Technologie dar. Diese optische Biosensormethode ermöglicht die markierungsfreie Echtzeitanalyse von Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen. Für die vorliegende Arbeit wurde die Annahme verfolgt, dass über den mit Antikörpern funktionalisierten Biosensor die Bindung von Viren erfasst werden kann. Für die Untersuchung der SCORE-Technologie zur Diagnostik von Virusinfektionen wurden humanpathogene Viren (Gelbfieber-, Dengue-, FSME- und Vacciniaviren) angezüchtet und monoklonale Antikörper (mAk) für den Nachweis der genannten Viren im Labormaßstab hergestellt. In den Messungen mit einem SCORE-Prototyp konnten mAk identifiziert werden, die für das entsprechende Virus als einzige eine Bindung oder ein relevant stärkeres Signal als die weiteren getesteten mAk aufweisen. Eine Unterscheidung der Viren auf Basis der spezifischen Bindungsmuster der mAk konnte unter Einbeziehung der Probenvorbereitung in weniger als 10 min, sowohl bei 22 °C als auch bei 37 °C erfolgen. Darüber hinaus war auch der Nachweis von Antikörpern möglich. Untersuchungen zur Sensitivität zeigten, dass die Nachweisgrenze für das Gelbfiebervirus deutlich unterhalb des möglichen virämischen Virustiters einer Gelbfieber-Infektion liegt. Bezüglich der Messbedingungen konnten der pH-Wert, die Ionenstärke, das Puffersystem sowie die Konzentration der mAk und des Virus als beeinflussende Faktoren für den Virus-Nachweis identifiziert werden. Außerdem wurde gezeigt, dass die Spezifität bzw. Funktionalität der mAk neben den Messbedingungen auch vom Messsystem abhängig ist. Insgesamt zeigt die Arbeit, dass mit der SCORE-Technologie eine schnelle, robuste, sensitive, spezifische Messplattform zur Verfügung steht, welche grundsätzlich für die Virusdiagnostik geeignet ist. Unter Berücksichtigung der Weiterentwicklung des verwendeten Prototyps durch die Biametrics GmbH und den damit verbunden Verbesserungen in Hinblick auf Probenhandhabung und Bedienung, ist die SCORE-Technologie daher prinzipiell als Point-of-Care-Diagnostik für Virusinfektionen geeignet.
The rapid detection of viral infections is a decisive prerequisite for ensuring a diagnosis and adequate treatment of patients. The "ideal diagnostic test" should be i.a. sensitive, specific, fast, robust, easy to handle, free of sophisticated equipment and cost-effective. This facilitates its broad applicability and opens up the possibility of carrying out the test without a central diagnostic laboratory, e. g. directly at the physician or in the field (point-of-care test). Only reliable diagnostics can ensure that patients are treated efficiently and that appropriate measures are taken to prevent the spread of infectious diseases. Conventional detection methods for diagnostics are time-consuming, cost-intensive, require several sample processing steps, adequate laboratory equipment or trained personnel, which limits their applicability, e.g. also as a point-of-care test. The SCORE technology represents a promising new method for virus diagnostics and point-of-care testing. This optical biosensor method enables label-free real-time analysis of interactions between biomolecules. The present work is based on the assumption that the binding of viruses can be detected via the biosensor functionalized with antibodies. To examine the potential of the SCORE technology for the diagnosis of viral infections human pathogenic viruses (yellow fever, dengue, tick-borne encephalitis and vaccinia viruses) were cultivated and monoclonal antibodies (mAb) were produced on a laboratory scale. In measurements with a SCORE prototype mAb could be identified which were the only ones with a binding or a relevantly stronger signal than the other mAb tested for the corresponding virus. A differentiation of the viruses on the basis of specific binding patterns of the mAb was possible in < 10 min including the sample preparation, at 22 °C as well as at 37 °C. Moreover, the detection of antibodies was also possible. Sensitivity studies showed that the detection limit for the yellow fever virus is well below the possible virus titer during a yellow fever infection. With regard to the measuring conditions, pH value, ionic strength, buffer system as well as the concentration of mAb and virus were identified as influencing factors for virus detection. It was also shown that the specificity or functionality of the mAb depends not only on measuring conditions but also on the measuring system. Overall, the work shows that the SCORE technology provides a fast, robust, sensitive, specific measurement platform that is basically suitable for virus diagnostics. Taking into account the further development of the prototype by Biametrics GmbH leading to improvements with regard to sample handling and operation, the SCORE technology is in principle suitable as point-of-care diagnostics for viral infections.
Databáze: OpenAIRE
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