Funktionelle Analyse von Cryptochrom 3 aus Arabidopsis thaliana

Autor: Reisbacher, Stefan
Přispěvatelé: Batschauer, Alfred (Prof. Dr.)
Jazyk: němčina
Rok vydání: 2009
Předmět:
DOI: 10.17192/z2009.0699
Popis: Cryptochromes are blue/UV-A light photoreceptors, which are closely related to photolyases but do not show DNA repair activity. Apart from the classical plant cryptochromes cry1 and cry2, a third Cryptochrom was identified in Arabidopsis thaliana. Cryptochrome 3 (cry3) belongs to the subfamily of the DASH cryptochromes and was shown to be localized in the chloroplasts and mitochondria. Although cry3 has been characterized quite well considering protein structure and biochemical properties, the biological function of this protein in the plant remains unknown until today. In this thesis the biological function of cry3 in the plant has been investigated. The localization of cry3 in chloroplasts and mitochondria could be confirmed by immunological studies on organellar fractions of Arabidopsis cell culture and immunolocalization studies using gold labelled secondary antibodies. Therefore any artefacts of the previous localization studies by overexpression and GFP fusion of cry3 can be excluded. At transcript level CRY3 expression is regulated by light. During the early phase of deetiolation cry3 is transiently induced mainly by far-red light. Phytochrome A was identified as the responsible photoreceptor for this regulation of cry3. PIF1 and PIF3 are also involved in this phytochrome dependent process. In adult plants grown in light / dark cycles, CRY3 expression shows a circadian regulation, which is also affected by the photoperiod. For functional analysis of cry3, several seed collections were screened for cry3 mutants and transgenic cry3 lines were produced. For further functional analysis cry3 overexpressor lines, RNAi knock-down lines, a cry3 knock-out transposon line and several T-DNA insertion lines with altered CRY3 expression and truncated cry3 c-term are now available. Two of these mutant lines are affected in seed germination under limiting light conditions. However this phenotype could not be proven beyond any doubt. Apart from this reduced germination rate the analyzed cry3 lines did not show any clear phenotypic differences compared to wild type plants. Cry3 does not seem to affect blue, green or UV light dependent regulation of plastid genes in Arabidopsis. Growth of Arabidopsis plants treated with elevated levels of UV-B light is not affected by cry3, although cry3 has been described to repair UV lesions in vitro in single stranded DNA and in double stranded DNA with loop structures. The results of this thesis clearly disagree with a function for cry3 as a DNA repair enzyme, because the PCR based repair assay described here could not detect any effect of cry3 on the repair activity in chloroplasts, mitochondria or in the nucleus.
Cryptochrome sind Blau-/UVA-Photorezeptoren, die eng mit den Photolyasen verwandt sind, aber keine DNA-Reparaturaktivität besitzen. Neben den „klassischen“ pflanzlichen Cryptochromen cry1 und cry2 wurde in Arabidopsis thaliana mit Cryptochrom 3 (cry3) ein drittes Cryptochrom identifiziert. Dieses Cryptochrom aus der Familie der DASH-Cryptochrome wurde als plastiden- und mitochondrienlokalisiertes Protein beschrieben. Obwohl Cryptochrom 3 schon sehr gut strukturell und biochemisch charakterisiert ist, konnte die biologische Funktion dieses Proteins in der Pflanze bisher noch nicht aufgeklärt werden. In dieser Arbeit wurde daher die biologische Funktion von cry3 in der Pflanze untersucht. Die cry3-Lokalisation in Chloroplasten und Mitochondrien konnte durch Zellfraktionierung und Immunolokalisationsstudien eindeutig bestätigt werden. Damit konnten Artefakte bei den bisherigen Untersuchungen durch die Überexpression und GFP-Fusion von cry3 ausgeschlossen werden. Die CRY3-Expression wird auf der Transkript-Ebene durch Licht reguliert. CRY3 wird während der Deetiolierungsphase hauptsächlich durch dunkelrotes Licht transient induziert. Phytochrom A konnte als der hauptverantwortliche Photorezeptor für diese Reaktion identifiziert werden. An dieser phytochromabhängigen Regulation sind auch PIF1 und PIF3 beteiligt. In ergrünten Pflanzen unterliegt die CRY3-Expression einer circadianen Regulation, welche anscheinend auch durch die Photoperiode beeinflusst wird. Zur funktionellen Analyse von Cryptochrom 3 wurden cry3-Mutanten in verschiedenen Mutanten-Kollektionen identifiziert und außerdem verschiedene cry3-Linien hergestellt. Zur weiteren Untersuchung der cry3-Funktion steht eine cry3-Überexpressionslinie, eine RNAi-knock-down-Linie, eine cry3-knock-out-Linie mit einer Transposon-Insertion, verschiedene T-DNA-Insertionslinien mit veränderter CRY3-Expression bzw. verkürztem cry3 C-Terminus, sowie eine putative knock-out-Linie mit einer Punktmutation in der splicing Erkennungssequenz zur Verfügung. Zwei dieser Mutantenlinien waren in ihrer Keimungsfähigkeit unter spezifischen Bedingungen beeinträchtigt. Der Keimungsphänotyp konnte in dieser Arbeit allerdings nicht eindeutig belegt werden. Abgesehen von dieser reduzierten Keimrate waren bei den untersuchten transgenen cry3-Linien keine offensichtlichen phänotypischen Unterschiede festzustellen. Auch ein Einfluss von cry3 auf die Blau-, Grün- und UV-Licht-abhängige Regulation von plastidenkodierten Genen konnte nicht nachgewiesen werden. Das Wachstum von Arabidopsis unter erhöhter UV-B-Bestrahlung wird durch cry3 nicht beeinflusst. Für cry3 ist zwar in vitro eine Photolyasefunktion bei einzelsträngiger DNA und doppelsträngiger DNA mit loop-Strukturen beschrieben worden, dennoch sprechen die Ergebnisse dieser Arbeit gegen eine in vivo Funktion von cry3 als DNA-Reparaturenzym, weil durch einen PCR-basierten Reparatur-assay kein Einfluss von cry3 auf die DNA-Reparatur in Chloroplasten und Mitochondrien nachgewiesen werden konnte.
Databáze: OpenAIRE
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