Connections between cell mechanics and Chromatin condensation in embryonic stem cells

Autor:	Höpfler, Markus
Jazyk:	angličtina
Rok vydání:	2011
DOI:	10.25365/thesis.16821
Popis:	Pluripotenz spielt eine Schlüsselrolle in embryonalen Stammzellen (ES Zellen) sowie im Epiblasten, dem Ursprungsgewebe des Embryos. Die Charakterisierung dieses speziellen Zustands der Pluripotenz und der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen hat die Wissenschaft seit Jahrzehnten inspiriert. In dieser Studie haben wir eine Mischung aus bewährten und neuen Methoden verwendet um biophysikalische Veränderungen zu untersuchen, die in Stammzellen, die auf transkriptioneller Ebene heterogen sind, schon vor der Differenzierung passieren. Nanog ist ein Transkriptionsfaktor, der Pluripotenz stabilisiert und dessen Expressionslevel zwei unterschiedliche Zustände innerhalb der Pluripotenz definieren: Zellen mit hohem Nanog Expressionslevel sind stabil pluripotent während Zellen mit niedrigen Levels zur Differenzierung tendieren. Wir haben mittels optischer Zelldehnung herausgefunden, dass letztere Zellen leichter verformbar sind als stabil pluripotente Zellen. Das Zytoskelett spielt eine prominente Rolle für die mechanischen Eigenschaften einer Zelle; deswegen haben wir die Struktur von Zytoskelettfilamenten in ES Zellen untersucht. In immunohistochemischen Analysen von adherenten sowie abgelösten Zellen fanden wir jedoch keine Unterschiede zwischen den beiden Zuständen. Zusätzlich konnten wir ausschließen, dass Veränderungen in der Proliferationsgeschwindigkeit oder in den relativen Volumenverhältnissen zwischen Kern und Zytoplasma für die mechanischen Unterschiede verantwortlich waren. Der Einfluss des Zellkerns auf die mechanischen Eigenschaften der gesamten Zelle sind nicht sehr gut untersucht, allerdings sind Kerne in ES Zellen vergleichsweise groß und daher zogen wir in Betracht, dass Kerne die Zellverformbarkeit mitbestimmen könnten. Um die mechanischen Eigenschaften von Kernen zu messen, haben wir eine neue Methode entwickelt, bei der Kerne in intakten Zellen verformt werden können. Mit dieser Methode fanden wir Unterschiede in der Kernverformung wie wir sie für die unterschiedlichen Zellpopulationen gesehen haben. Um die Substruktur des Kerns zu untersuchen, haben wir Histon-Mobilität eines markierten Histons mit einer Photobleaching Technik untersucht und zusätzlich die Verteilung des Heterochromatin-spezifischen Proteins HP1α analysiert. Die Ergebnisse beider Analysen stimmten darin überein, dass Chromatin im stabil pluripotenten Zustant, in dem Zellen und Kerne steifer waren, stärker kondensiert ist. Mit verschiedenen Chemikalien beeinflussten wir spezifisch die Chromatin-Kondensierung und konnten zeigen, dass sowohl Zell- als auch Kern-Verformbarkeit mit Dekondensierung steigen, ein Hinweis darauf, dass die Kernmechanik die Zellmechanik insgesamt beeinflusst. Wir postulieren daher, dass Chromatin-Kondensation eine zentrale Rolle für die Regulation der Pluripotenz spielt und dass Chromatin erst dekondensiert werden muss bevor Zellen einer Entwicklunslinie folgen können und die Formation von Heterochromatin stattfinden kann. Die Verbindung zwischen den Eigenschaften des Chromatins mit der Zellmechanik hat weitreichende Konsequenzen für die Regulation von frühen embryonalen Entscheidungen und Sortierungsprozessen von Zellen. Zusätzlich zu bekannten biochemischen und positionsabhängigen Signalen könnten biophysikalische Eigenschaften regulatorische Mechanismen in der frühen Embryonalentwicklung darstellen. Pluripotency is a key feature of embryonic stem (ES) cells and the founder tissue of the embryo proper, the epiblast. The characterization of the properties of pluripotent cells and the molecular regulation of this state has inspired much research over the last decades. Here, we used a mix of well established and novel techniques to investigate biophysical changes that occur in the transcriptionally heterogeneous state of pluripotency in mouse ES cells even before differentiation. The expression levels of Nanog, a transcription factor that stabilizes pluripotency, can distinguish two states of pluripotency: Cells with high Nanog expression are in a stable pluripotent state while cells with low levels are prone to differentiate. We found that differentiation-prone cells are softer on average as compared to stable pluripotent cells when we tested global cell mechanics by optical stretching. The cytoskeleton is usually critical in determinining mechanical properties of cells; therefore, we investigated the structure of the cytoskeleton in ES cells but we found no detectable difference between the two states in immunohistochemical stainings of attached and suspended cells. Furthermore, we ruled out that changes in proliferation speed or in the relative amounts of nuclear and cytoplasmatic volume caused the observed effect. The role of nuclear stiffness on overall cell mechanics is not well understood, however, nuclei in ES cells are comparably big and so we considered a role of nuclei in cell compliance. To probe nuclear mechanics, we demonstrated a novel method that allows to stretch nuclei within intact cells. Indeed, we found changes of the response of nuclei to stretching forces that are in line with cell mechanics changes. To assess nuclear substructure, we analyzed chromatin structure by testing histone mobility using fluorescence recovery after photobleaching of a tagged histone and analyzing the distribution of the heterochromatin marker HP1α in ES nuclei. The results of both assays agree well in that chromatin was more condensed in the stable pluripotent state where cells and nuclei were stiffer. We used chemical treatments to change chromatin condensation and showed that both nuclear compliance and cell compliance increase with chromatin decondensation, indicating that nuclear mechanics influence overall cell mechanics in ES cells. We propose that chromatin condensation plays a crucial role in the regulation of pluripotency and that chromatin has to be decondensed before lineage commitment and heterochromatinization can occur. The connection between chromatin state and cell mechanics has far reaching implications for the regulation of early embryonic fate decisions and cell sorting processes. In addition to well-known biochemical and positional cues, biophysical properties could act as a regulatory mechanism in early embryonic development.
Databáze:	OpenAIRE
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