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Ausgangspunkt für die vorliegenden Studien zu PKS-Ketoreduktase-Domänen waren die β-Hydroxy-α-methyl-Strukturelemente verschiedener Polyketid-Naturstoffe. Über mehrere Validierungsstufen wurde eine Auswahl von Ketoreduktase-Domänen getroffen, die das Spektrum reduktionsaktiver Ketoreduktase-Typen abdeckte und Domänen früher, wie auch später Module umfasste. Die MS/MS-Protein-identifizierung bestätigte anschließend die erfolgreiche Genexpression und Isolierung der korrekten Proteindomänen. Insgesamt standen somit sieben rekombinante KR Domänen mit insgesamt elf Derivaten für die Enzymaktivitätstests zur Verfügung. Die für die Studien benötigten β-Keto-α-methyl-Substrate sollten über eine Route mit möglichst direktem Zugang zu einem breiten Spektrum an Derivaten dargestellt werden. Die effiktivste der untersuchten Synthesestrategien basiert im Schlüsselschritt auf einer decarboxylativen CLAISEN-Kondensation nach MASAMUNE et al. Diese biomimetische Synthesestrategie ermöglichte die Darstellung verschiedener Derivate auf der vorletzten Stufe. Insgesamt waren 14 β-Keto-α-methyl-Derivate zugänglich, wobei der Fokus auf den SNAC-Thioestern lag. Der nächste Schritt beinhaltete die Etablierung eines geeigneten photometrischen Messverfahrens für die Reaktionsverfolgung. Diese erfolgte über den NADPH-Verbrauch während der enzymatischen Reduktion. Zur Validierung dieser Methode wurden die Versuche zu einer Reihe an KR-Domänen von WEISSMAN et al. erfolgreich reproduziert. Hierauf basierend, wurden die relativen Aktivitäten für alle Enzym-Substrat-Kombinationen ermittelt und weiterführend die Reduktionsprodukte auf den Umsatz und die Konfiguration des β-Hydroxy-α-methyl-Motivs hin untersucht. Die Ketoreduktase Domänen mit den höchsten relativen Aktivitäten über das gesamte SNAC-Substratspektrum waren TylKR1, AmpKR2, sowie MycKRA. Die anderen Domänen zeigten eine stärker ausgeprägte substratabhängige Reduktionsaktivität. Je strukturell näher das Surrogat allerdings dem natürlichen Substrat war, desto höher waren die Aktivität und die Stereoselek¬tivität. EryKR1 reduzierte mit hoher relativer Aktivität die kleinen Substrate K-MMN und K-EMN. Wohingegen EryKR6 und MycKRB die höchsten Werte bei den etwas größeren, linearen Substraten K-PaMN und K-PiMN aufwiesen. Die absolute Produktkonfiguration wurde anschließend mittels einer Kombination aus NMR-Untersuchungen der β-Hydroxy-Reduktionsprodukte und der entsprechenden 9-AMA-Ester bestimmt. Die Stereoselektivitäten der KR Domänen waren insgesamt sehr hoch, jedoch teilweise auch abhängig von der betrachteten Enzym-Substrat-Kombination. Die Orientierung des Substrats im aktiven Zentrum während der Katalyse ist dabei von zentraler Bedeutung. Je bevorzugter eine katalytisch aktive Orientierung eingenommen wird, desto stärker sollte dies in einer höheren Stereoselektivität resultieren. Mit den vorliegenden Ergebnissen konnten einerseits Studien von KEATINGE-CLAY, LÜDEKE und WEISSMAN reproduziert und bestätigen werden sowie andererseits das Spektrum an Enzym-Substrat-Kombinationen um Surrogate mit natürlichen und nicht-natürlichen Polyketidstrukturen vergrößert werden. Dabei zeigte sich, je ähnlicher die Polyketidstruktur der Surrogate denen der natürlichen Substrate war, desto höher waren die Stereoselektivitäten. Die Produktkonfigurationen entsprachen hierbei den in der Natur vorkommenden. Nicht-natürliche Substrate führten teilweise zu einer Abkehr von diesen Konfigurationen. Die gezeigten, signifikanten Wirkungen von kleinen tags, wie z. B. His6, auf die Aktivität der Ketoreduktase Domäne unterstreichen dabei, dass Interaktionen mit Distanz zum aktiven Zentrums ebenfalls Einfluss auf dieses nehmen können. Unmittelbar relevant für die Stereoselektivität sind aber die Interaktion der KR mit anderen Domänen, insbesondere der ACP über Protein-Protein-Wechselwirkungen, und die Protein-Substrat-Wechselwirkungen. Ein erstmaliger Einblick in den Einfluss von nicht-natürlichen Substraten und Surrogaten bei KR-Domänen später PKS-Module konnte in dieser Arbeit gezeigt werden. |
