Development and application of rapid isothermal amplification techniques for the analysis of food products

Autor: Zahradnik, Celine
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2014
Předmět:
DOI: 10.34726/hss.2014.8920
Popis: Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung DNA-basierter isothermaler Amplifikationstechniken f��r die rasche Analyse unerw��nschter Bestandteile in Lebensmitteln in den Bereichen Allergen- und GVO-Nachweise sowie Lebensmittelauthentifizierung. Obwohl durchaus Testsysteme f��r diese Zielbereiche existieren, sind viele der dabei angewandten Methoden komplex in der Durchf��hrung, zeitintensiv und lassen sich kaum in als vor-Ort-Analysen einsetzen. Kernthema dieser Studie ware die Entwicklung dreier isothermaler Amplifikations-Assays f��r die Analyten Sellerie, GVO-Mais und Pferdefleisch, um diese neuen Amplifikationstechniken in den Bereich Lebensmittelsicherheit zu transferien. Obwohl DNA-basierte Methoden f��r den Nachweis dieser Targets empfehlenswert sind, hat die konventionelle PCR mehrere Nachteile, die diese Methode ungeeignet f��r schnelle vor-Ort-Analysen machen. Die Anwendung isothermaler Amplifikationstechnologien kann viele dieser Nachteile eliminieren und ebnet den Weg f��r eine neue Generation DNA-basierter Test-Methoden. Seit 2005 wird die Etikettierung von Sellerie und Sellerieprodukten aufgrund des allergenen Potentials durch die Richtlinie 2003/89/EC der Europ��ischen Kommission vorgeschrieben. Im Zuge der Entwicklung von DNA-basierten und einfach durchzuf��hrenden Test-Methoden, welche eine rasche Analyse erlauben, wurde ein Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay f��r den Nachweis von Sellerie (Apium graveolens) entwickelt. Dieser Test wurde auf seine Spezifit��t f��r Sellerie untersucht, da eine Vielzahl von eng verwandten Arten ebenso gro��e Bedeutung in der Lebensmittelindustrie besitzt. Die Nachweisgrenze f��r mit Sellerie versetzten Proben lag bei 7.8 mg Selleriepulver pro Kilogramm. Eine Evaluierung verschiedener Amplifikations- und Detektionsplattformen konnte die zuverl��ssige Detektion, unabh��ngig von verwendeten Ger��ten (Thermocycler oder Heizblock) und Nachweismechanismen (real-time Fluoreszenzmessung, Agarosegelelektrophorese oder Nukleins��ure-F��rbung), zeigen. Die Analyse zehn kommerzieller Lebensmittelprodukte mit m��glichst komplexen Matrices ergab eine Falsch-Negativ-Rate von 0% f��r 24 Target-Kopien bzw. 0.08 ng Sellerie-DNA in drei ausgew��hlten Produkten und zeigt, da�� LAMP das Potenzial als alternative Nachweis-Strategie f��r die Detektion von allergenem Sellerie besitzt. Die Effizienz des entwickelten LAMP-Assays ist wenigstens als gleichwertig anzusehen im Vergleich zu fr��her entwickelten PCR-Assays f��r Sellerie in Lebensmitteln. Diese Studie wurde im Journal Analytical & Bioanalytical Chemistry publiziert (Publikation #1). Im Jahre 2003 wurde von der Europ��ischen Kommission eine Grenze von 0.9 % f��r gentechnisch ver��nderte Organismen (GVOs) und daraus abgeleitete Produkte in Lebens- und Futtermitteln eingef��hrt. F��r Produkte, die diesen Grenzgehalt ��berschreiten, ist die entsprechende Etikettierung verpflichtend. Im Zuge der Entwicklung von DNA-basierten und einfach durchzuf��hrenden Testmethoden, welche eine rasche und unkomplizierte Analyse erlauben, wurden verschiedene Isothermale Amplifikationstechniken f��r den Nachweis des P35S-Promoters untersucht: Strand Displacement Amplification, Nicking-Enzyme Amplification Reaction, Rolling Circle Amplification, Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) und Helicase-dependent Amplification (HDA). Die entwickelten Assays wurden auf ihre Selektivit��t hinsichtlich der Unterscheidung zwischen gentechnisch ver��ndertem und nicht ver��ndertem Mais untersucht. F��r diejenigen Techniken, die eine entsprechenden Diskriminierung zwischen GVO-Mais und Nicht-GVO-Mais erlauben, wurde eine Nachweisgrenze ermittelt. Zus��tzlich wurde die Falsch-Negativ-Rate ermittelt, um eine Deklaration von GVO-Mais als nicht GVO-Mais auszuschlie��en. Ebenso wurde Tests durchgef��hrt um einen zuverl��ssigen Nachweis, unabh��ngig von verwendeten Instrumenten, zu gew��hrleisten. Die Analyse von drei verschiedenen GVO-Mais-Sorten zeigte, da�� lediglich LAMP und HDA in der Lage waren, zwischen den gentechnisch ver��nderten Mais-Sorten MON810, NK603 und Bt11 und Nicht-GVO-Mais zu unterscheiden. F��r die HDA konnte au��erdem eine Nachweisgrenze von 0.5 % realisierte werden, sowie eine Falsch-Negativ-Rate von 5 % f��r alle drei Sorten 1%-GVO-Mais. Dies zeigt, da�� die HDA als alternative Nachweis-Strategie f��r GVO-Mais eingesetzt werden kann. Alle Ergebnisse f��r LAMP und HDA wurden mit einem fr��her publizierten real-time PCR-Assay zum Nachweis des P35S-Promoters in gentechnisch ver��ndertem Mais verglichen. Diese Studie erl��utert die Entwicklung zwei neuer Screening-Assays f��r den P35S-Promoter in GVO-Mais mittels isothermaler Amplifikationstechniken. Diese Studie wurde im Journal Analytical & Bioanalytical Chemistry publiziert (Publikation #2). In der dritten Studie wird die Entwicklung einer simplen und schnellen Nachweis-Technik f��r Pferdefleisch in prozessierten Lebensmitteln beschrieben. Ziel-Molek��l der spezifisch entwickelten LAMP-Primer ist das mitochondriale Genom der Spezies Pferd (Equus caballus). F��r Rind-, Schweine- und H��hnerfleisch konnten keine Kreuzreaktionen beobachtet werden, eine zuverl��ssige Nachweisgrenze von 0.1 ng extrahierte Pferde-DNA wurde ermittelt. Die Analyse von Modell-W��rsten mit definiertem Pferdefleischgehalt konnte zeigen, da�� der entwickelte Assay Gehalte von 0.1 % Pferdefleisch, unabh��ngig von Kochzeiten, zuverl��ssig nachweisen kann. Zus��tzlich wurden f��nf verschiedene, kommerziell erh��ltliche Pferdefleischprodukte untersucht, um au��erdem eine Unabh��ngigkeit von Lebensmittelmatrices zu zeigen. Alle Experimente wurden auf einem Heizblock durchgef��hrt, die Detektion erfolgte visuell mittels eines interkalierenden Farbstoffes. Die Ergebnisse wurden mittels real-time Fluoreszenzmessung mit einem zuvor publizierten PCR-Assay f��r den Nachweis von Pferdefleisch verglichen. Diese Methode stellt eine einfach und effiziente Alternative f��r den Nachweis von Pferdefleisch in der Zukunft dar. Diese Studie wurde im Journal Food Analytical Methods publiziert (Publikation #3). Die in dieser Arbeit entwickelten Methoden stellen eine neue und vielversprechende Alternative zu konventionellen Testsystemen f��r Lebensmittelprodukte dar, die bislang nur im Labor durchf��hrbar und mit entsprechendem Zeit- und Personalaufwand verbunden sind. F��r alle untersuchten Analyten (Sellerie, GVOs, Pferdefleisch) ist ein DNA-basiertes Testsystem notwendig, da ein spezifischer Nachweis ohne Co-Detektion andere Inhaltsstoffe nur ��ber die entsprechende DNA-Sequenz m��glich ist. Isothermale Amplifikationsmethoden bieten die M��glichkeit, diese Analyten ohne besonderen Ger��teaufand in wesentlich k��rzerer Zeit vor Ort nachzuweisen und werden in Zukunft dazu beitragen, umfangreiche Kontrollen mit einer gro��en Anzahl an Proben rasch und einfach durchzuf��hren.
The main objective of this thesis was the development of DNA-based isothermal amplification techniques for the rapid analysis of unwanted compounds in food products with focus on allergens, GMOs and animal species identification. Although tests for said analytes are available, many of these methods are laborious, time-consuming and difficult to transfer into a more field-applicable approach. Core of this thesis was the development of three isothermal amplification assays for the detection of the food allergen celery, transgenic maize and horse meat to show a methodical transfer of these techniques to matters of food safety. Although a DNA-based approach for the detection of these targets is recommended, conventional PCR has several drawbacks that make it unsuitable for the rapid on-site analysis of foods. The application of isothermal amplification techniques eliminates many of these drawbacks and smoothens the way for a new generation of DNA-based assays. Since 2005, celery and celery products have to be labeled according to Directive 2003/89/EC due to their allergenic potential. In order to provide a DNA-based, rapid and simple detection method, a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for the detection of celery (Apium graveolens) was developed. The assay was tested for specificity for celery since closely related species also hold food relevance. The limit of detection (LOD) for spiked food samples was found to be as low as 7.8 mg of dry celery powder per kilogram food product. An evaluation of different amplification and detection platforms was performed to show reliable detection independent from the instrument used for amplification (thermal cycler or heating block) and detection mechanisms (real-time fluorescence detection, agarose gel electrophoresis or nucleic acid staining). The analysis of 10 commercial food samples representing diverse and complex food matrices, and a false-negative rate of
Databáze: OpenAIRE
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