Microenvironment-mediated cancer dormancy and metastasis: implications for cell biophysics and biology

Autor: Bakhshandeh, Sadra
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2023
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DOI: 10.14279/depositonce-15284
Popis: Curatively resected solid cancers often relapse with distant metastasis (the bone being among the preferred sites), despite systemic administration of molecularly tailored (neo)adjuvant or chemo-therapies. Outgrowth of tumor cells disseminated to secondary organs might not occur instantly, with recurrences ranging from years to decades, pointing to the fact that a number of these cells might go into a drug-resistant state of dormancy. The rarity and complexity associated with detection, isolation and analysis of disseminated tumor cells (DTCs) in disease-free patients have called for an urgent need to develop in vitro culture systems to artificially mimic this asymptomatic state of cancer metastasis, therefore enabling scalable drug screening campaigns to identify drugs able to target DTCs. Recent studies have found dense extracellular matrix (ECM) confining individual disseminated cancer cells, hinting to ECM-mediated mechanical confinement to be a plausible mechanism inducing cancer dormancy. Here we engineered a quiescence-inducing three-dimensional (3D) engineered matrix using ultraviolet (UV) light-initiated covalently-crosslinked thiol-ene alginate hydrogels, which generates mechanical confinement inducing growth arrest of weakly and highly metastatic breast cancer cell lines. After extensive material characterization of the engineered platform, as well as thorough phenotypic profiling (i.e. viability, metabolic activity, cell cycle state, proliferation, drug sensitivity) of the encapsulated cells, we looked at the biophysical properties of these growth-arrested cells with state-of-the-art contact/label-free techniques. Specifically, we quantitatively mapped the 3D mass density distribution of encapsulated human breast cancer cells (BCCs) MDA-MB-231, using a combined optical diffraction tomography (ODT)-epifluorescence microscope. We then mapped the 3D viscoelastic properties of these cells via Brillouin spectroscopy. Surprisingly, and in contrast to cells adhering to 2D substrates, the nuclei of cells in 3D revealed a higher mass density, as well as higher stiffness and viscosity compared to the cytoplasm. Next, we moved to a more molecular characterization (i.e. immunostaining of selected molecules, RNA seq) of growth-arrested cells. We showed that our artificial quiescence-inducing matrix selects for distinct populations of growth-arrested cells, with cells in the G0/G1 cell cycle phase being more resistant to confinement. Combined with RNA sequencing, we revealed a stiffness-dependent nuclear localization of the four-and-a-half LIM domains 2 (FHL2) protein as an underlying mechanism of quiescence, which led to a p53-independent p21Cip1/Waf1 expression, validated in human and murine tissue. Suggestive of a resistance-causing role, quiescent cells became sensitive against drug treatment upon FHL2 downregulation, evidencing the potential of our approach as a tool for the identification and targeting screens for novel compounds suited to eradicate potentially relapsing DTCs. Finally, we sought to observe how DTCs behave in the bone in a more physiologically relevant system. Building on a growing body of evidence suggesting the existence of parallels between DTCs and quiescent hematopoietic and progenitor stem cells (HSPCs), we seeded DTCs within a 3D hydroxyapatite-coated zirconium oxide scaffold pre-seeded with primary human mesenchymal stromal cells (MSCs) and human cord blood-derived multipotent HSPCs. Interestingly, we detected BCCs and HSPCs entrapped in a web-like network of fibronectin, with BCCs leaning towards a slow-proliferative state, hinting at a potential quiescence-inducing role for the bone microenvironment. Despite the inherent complexities associated with the molecular characterization of biological processes, viewing these phenomena from a physical perspective allows for a more global description, independent from many details of the systems. By drawing parallels with clinical and experimental data, and building on thermodynamic phase separation concepts, we classified microenvironmental-mediated dormancy mechanisms in terms of nucleation processes based on three distinct classes of interactions: (i) cells adhering to a wetting flat surface in the form of a spherical cap (ii) a spherical droplet enclosed by an elastic sheath as a mechanical interpretation of extracellular matrix (ECM)-mediated confinement, and (iii) a spherical droplet with size-dependent limited growth due to lack of nutrients and oxygen, leading to cell apoptosis deep inside the tissue. We then advance the notion that local energy minima, or metastable states, emerging in the tissue droplet growth kinetics can be considered proxies of dormant states. Despite its simplicity, the provided framework captures several aspects associated with cancer dormancy and tumor growth.
Bei kurativ resezierten soliden Tumoren kommt es trotz systemischer Verabreichung molekular adaptierter (neo)adjuvanter Behandlungen oder Chemotherapien häufig zu einem Rückfall mit Metastasen in anderen Organen (wobei Knochen zu den am häufigsten betroffenen Organen gehören). Die Bildung von Metastasen in sekundären Organen erfolgt möglicherweise nicht sofort, sondern kann Jahre bis Jahrzehnte dauern, was darauf hindeutet, dass eine Reihe der Krebszellen in einen arzneimittelresistenten Ruhezustand übergeht. Durch die Seltenheit und die Komplexität, die mit dem Nachweis, der Isolierung und der Analyse von disseminierten Tumorzellen (DTCs) in symptomfreien Patienten verbunden sind, ist es dringend notwendig, in-vitro-Kultursysteme zu entwickeln, die diesen asymptomatischen Zustand der Krebsmetastasierung künstlich nachahmen. Dadurch werden skalierbare Wirkstoffscreening-Kampagnen zur Identifizierung von Medikamenten ermöglicht, die gegen DTCs gerichtet sind. Jüngste Studien haben gezeigt, dass eine dichte extrazelluläre Matrix (ECM) einzelne disseminierte Krebszellen einschließt, was darauf hindeutet, dass die ECM-vermittelte mechanische Einschließung ein plausibler Mechanismus ist, der die Krebszellenruhe auslöst. Wir haben eine Ruhe-induzierende 3D-Matrix unter Verwendung von kovalent vernetzten Thiol-En-Alginat-Hydrogelen mit ultraviolettem (UV) Licht entwickelt, welche einen mechanischen Einschluss erzeugt, der das Wachstum von schwach und stark metastasierenden Brustkrebszelllinien blockiert. Nach einer umfassenden Materialcharakterisierung der entwickelten Plattform sowie einer gründlichen phänotypischen Beschreibung (d.h. Viabilität, Stoffwechselaktivität, Zellzykluszustand, Proliferation, Medikamentenempfindlichkeit) der eingekapselten Zellen haben wir die biophysikalischen Eigenschaften dieser wachstumsfixierten Zellen mit modernsten kontakt- und markierungsfreien Techniken untersucht. Insbesondere haben wir die 3D Massendichteverteilung der eingekapselten menschlichen Brustkrebszellen (BCC) MDA-MB-231 mit einer kombinierten optischen Beugungstomographie (ODT) und Epifluoreszenz- Mikroskop quantitativ ausgewertet. Anschließend haben wir die viskoelastischen 3D-Eigenschaften dieser Zellen mittels Brillouin-Spektroskopie erfasst. Im Gegensatz zu Zellen die auf 2D Substraten haften, wiesen die Kerne von Zellen in der 3D Umgebung überraschenderweise eine höhere Massendichte sowie eine höhere Steifigkeit und Viskosität im Vergleich zum Zytoplasma auf. Als Nächstes sind wir zu einer molekularen Charakterisierung (d. h. Immunfärbung ausgewählter Moleküle, RNA-Sequenzierung) von Zellen mit Wachstumsstillstand übergangen. Wir konnten zeigen, dass unsere künstliche, Ruhe-induzierende Matrix unterschiedliche Populationen von wachstumsgestoppten Zellen selektiert, wobei Zellen in der G0/G1-Zellzyklusphase resistenter gegen die Blockade sind. In Kombination mit der RNASequenzierung konnten wir eine steifigkeitsabhängige Kernlokalisierung des Proteins ‚Four-and-a-half LIM-Domains 2‘ (FHL2) als zugrundeliegenden Mechanismus des Ruhezustandes nachweisen. Diese Lokalisation führt zu einer p53-unabhängigen p21Cip1/Waf1-Expression, welche in menschlichem und murinem Gewebe validiert wurde. Die ruhenden Zellen reagieren nach der Herunterregulierung von FHL2 empfindlich auf eine medikamentöse Behandlung, was auf eine resistenzverursachende Rolle von FHL2 hindeutet und das Potenzial unseres Ansatzes als Instrument für die Identifizierung und gezielte Suche von neuen Wirkstoffen zur Ausrottung potenziell rezidivierender DTCs belegt. Schließlich wollten wir in einem physiologisch relevanteren System beobachten, wie sich DTCs im Knochen verhalten. Aufbauend auf einer wachsenden Zahl von Hinweisen auf Parallelen zwischen DTCs und ruhenden hämatopoetischen Vorläufer-Stammzellen (HSPCs) haben wir DTCs in ein mit primären humanen mesenchymalen Stromazellen (MSCs) und multipotenten HSPCs, aus menschlichem Nabelschnurblut, vorbesiedeltes 3D Hydroxylapatitbeschichtetes Zirkonoxid-Gerüst ausgesät. Interessanterweise können wir BCCs und HSPCs nachweisen, die in einem spinnwebenartigen Netzwerk aus Fibronektin eingeschlossen sind, wobei die BCCs zu einem langsam proliferativen Zustand neigen, was auf eine potenziell ruhezustandsfördernde Rolle der Knochenmikroumgebung hindeutet. Trotz der inhärenten Komplexität, die mit der molekularen Charakterisierung biologischer Prozesse verbunden ist, ermöglicht die Betrachtung dieser Phänomene aus einer physikalischen Perspektive eine globalere Beschreibung, die von vielen Details der Systeme unabhängig ist. Durch das Ziehen von Parallelen von klinischen und experimentellen Daten und aufbauend auf thermodynamischen Phasentrennungskonzepten haben wir die durch die Mikroumgebung vermittelten Ruhemechanismen in Form von Keimbildungsprozessen klassifiziert, die auf drei verschiedenen Klassen von Wechselwirkungen basieren: (i) Zellen, die an einer benetzenden flachen Oberfläche in Form einer kugelförmigen Kappe haften, (ii) ein kugelförmiges Tröpfchen, das von einer elastischen Hülle umschlossen wird, als mechanische Interpretation der durch die extrazelluläre Matrix (ECM) vermittelten Begrenzung, und (iii) ein kugelförmiges Tröpfchen mit größenabhängig begrenztem Wachstum aufgrund von Nährstoff- und Sauerstoffmangel, was zur Zellapoptose tief im Gewebe führt. Anschließend stellen wir die These auf, dass lokale Energieminima oder metastabile Zustände, die in der Wachstumskinetik des Gewebetropfens auftreten, als Stellvertreter für ruhende Zustände betrachtet werden können. Trotz seiner Einfachheit erfasst das vorgestellte Modell mehrere Aspekte im Zusammenhang mit Krebsruhezuständen und Tumorwachstum.
Databáze: OpenAIRE
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