| Popis: |
Микробная деградация играет существенную роль в процессах детоксикации устойчивых поллютантов, попадающих в окружающую среду в результате практической деятельности человека. Способность к деградации широкого спектра органических соединений, в том числе, токсичных ксенобиотиков, особенно характерна для бактерий рода Pseudomonas. Многие природные штаммы псевдомонад несут плазмиды биодеградации, которые, как правило, детерминируют расщепление одного типа соединений. Ранее нами было показано, что способность бактерий рода Pseudomonas утилизировать токсичное неприродное соединение epsilon-капролактам (далее капролактам, КАП, используется для производства нейлона) детерминируется плазмидами (САР плазмидами), которые содержат генетическую информацию, необходимую для его полной минерализации [1].В условиях комплексного загрязнения почв совмещение у микроорганизмов нескольких катаболических оперонов в составе одного мобильного генетического элемента обеспечивает конкурентное преимущество их обладателям. Ранее были выделены плазмидосодержащие штаммы псевдомонад, способные утилизировать капролактам и салицилат в качестве единственных источников углерода и энергии. Впервые был описан новый тип плазмид биодеградации КАП (CAP/SAL плазмиды), в составе которых содержится второй катаболический оперон, детерминирующий утилизацию салицилата – центрального метаболита окисления многих ароматических соединений [2].В данном исследовании из активного ила городских очистных сооружений (г. Пущино, Моск. обл.) был выделен бактериальный штамм CT3, обладающий уникальной способностью разлагать одновременно капролактам, а также толуол и мета-ксилол в качестве единственных источников углерода и энергии. Цель работы – изучение генетического контроля деградации этих токсичных антропогенных соединений у штамма CT3.При выделении бактерий использовали минеральную среду М9 с КАП (1.0 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии. Секвенирование и филогенетический анализ гена 16S pРHK (1407 п.н.) выделенного штамма позволил отнести его к виду Pseudomonas putida. Уровень сходства гена 16S pРHK с последовательностью аналогичного гена типового штамма P. putida DSM 291 cоставил 100%. Нуклеотидная последовательность фрагмента гена 16S pРНК штамма P. putida СТ3 помещена в GenBank под номером MH553084.Как было сказано выше, деградация КАП у бактерий Pseudomonas контролируется САР плазмидами. Известно о существовании единственного пути разложения КАП. Что касается толуола (метилбензол, ТОЛ), то описано пять возможных путей его расщепления у бактерий. Для флуоресцирующих псевдомонад, к которым относятся штаммы P. putida, в том числе, и выделенный нами штамм СТ3, наиболее характерны два пути разложения толуола: TOL-путь, на начальных этапах которого происходит окисление боковой метильной группы под действием толуолмонооксигеназы, и TOD-путь, у которого трансформация толуола начинается с дигидроксилирования ароматического кольца толуолдиоксигеназой [3]. В связи с этим у штамма P. putida СТ3 был проведен ПЦР-анализ ключевых генов xylM (TOL-путь, ожидаемый ПРЦ-продукт размером 570 п.н.) и todC1 (TOD-путь, ожидаемый ПРЦ-продукт – 625 п.н.), кодирующих синтез толуолмонооксигеназы и толуолдиоксигеназы соответственно. В качестве положительного контроля использовали штаммы P. putida TOL25 (разложение толуола по TOD-пути) и P. putida TOL8 (TOL-путь разложения толуола). В результате амплификации целевых генов ПЦР-продукт был получен только для xylM, его размер соответствовал ожидаемому и составлял 570 п.н. Таким образом, был сделан вывод о том, что штамм P. putida CT3 окисляет толуол по ТОL-пути.Принимая во внимание тот факт, что до сих пор не описано ни одного бесплазмидного штамма-деструктора КАП, а разложение толуола по ТОL-пути у бактерий детерминируется, как правило, ТОL плазмидами [4], мы предположили, что деградация капролактама, толуола и мета-ксилола у штамма СТ3 может контролироваться плазмидными генами. Для выявления плазмид у исследуемого штамма был применен метод пульс-электрофореза геномной ДНК. Было показано, что в клетках P. putida СТ3 содержится мегаплазмида размером около 550 т.п.н. Для того, чтобы подтвердить плазмидную детерминацию признаков деградации КАП и/или ТОЛ был осуществлен конъюгационный перенос мегаплазмиды в бесплазмидный реципиентный штамм P. putida KT2442 (gfp, KmR, RifR). Селекцию трансконъюгантов проводили на минеральной среде с КАП или ТОЛ в качестве единственного источника углерода и энергии. В результате проведенных экспериментов колонии трансконъюгантов были получены только на среде с капролактамом, при этом они не утилизировали толуол и мета-ксилол. Дальнейший анализ САР+ трансконъюгантов показал присутствие в них плазмидной ДНК, по размеру идентичной плазмиде, содержащейся в донорном штамме. Многократные попытки получить трансконъюганты на среде с ТОЛ не увенчались успехом.Таким образом, в данной работе было получено доказательство плазмидной локализации генов деградации КАП у штамма P. putida СТ3, обладающего уникальной способностью к деградации капролактама, толуола и мета-ксилола. Что касается генов, детерминирующих разложение толуола и мета-ксилола, которые до сих пор были описаны только в составе TOL плазмид, по всей вероятности, у данного штамма они локализованы на хромосоме. |
