| Popis: |
Почвенные органогенные гиполитные горизонты встречаются на небольших свободных ото льда участках Антарктиды, называемых оазисами. Регулярные циклы замораживания-оттаивания, интенсивное УФ-излучение и резкая сезонность в совокупности с сильными ветрами и общим недостатком влаги, позволяют почвенным микроогранизмам выживать на 1–3 см ниже верхнего слоя адгезируясь к частицам мелкозёма. Биоту таких почв в основном составляют гетеротрофные бактерии, микромицеты, микроводоросли и цианобактерии, которые являются первичными продуцентами органического вещества. Биологическое разнообразие цианобактерий в подобных биоценозах представлено в основном нитчатыми осциллаториевыми и ностоковыми цианобактериями (Mergelov et al., 2020). Методом лабораторного культивирования из образцов почв оазиса Холмы Ларсеманн были получены накопительные культуры антарктических почвенных осциллаториевых цианобактерий. Штаммы выделяли при температуре +22 °С на минеральной среде BG-11 и постоянном освещении лампами дневного света (500 lx). Альгологически чистые культуры поддерживали на 1%-ной агаризованной или жидкой среде ВG-11. Форму и линейные параметры клеток определяли с помощью микроскопа Leica DM2500. Данные по линейным размерам клеток статистически обрабатывали. Таксономическая идентификация полученных штаммов проводилась с учетом комплекса их фенотипических признаков, таких как общая форма трихома, линейные размеры клеток, наличие или отсутствие калиптр у концевых клеток, некридий, а также чехлов. Основу полученной рабочей коллекции составили осциллаториевые цианобактерии, которые согласно морфологическому анализу были отнесены к р. Leptolyngbya, Phormidesmis и Pseudophormidium. Геномную ДНК выделяли с помощью набора DNeasy Plant Pro Kit (Qiagen) cогласно протоколу фирмы-производителя. Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК проводили праймерами 27F/1492R и 322F/340R. Полученные ПЦР-фрагменты секвенировали по Сэнгеру. Для уточнения таксономического статуса полученных штаммов был проведен анализ их молекулярно-генетических признаков с использованием данных секвенированных последовательностей гена 16S рРНК и внутренних транскрибируемых спейсеров rrn-оперона, а также анализ вторичной структуры внутренних транскрибируемых спейсеров (ITS) c помощью RNAStructure (https://rna.urmc.rochester.edu/). Для поиска сходных последовательностей использовали GenBank. Филогенетический анализ проводили с использованием метода Neighbor-Joining (NJ), Maximum Likelihood (ML) и Bayesian inference (BI) с помощью MEGA5.0 (Tamura et al., 2011), а также в MrBayes on XSEDE (3.2.7a) и RAxML-NG (1.1.0) сервера CIPRES Science Gateway v.3.3 (Miller et al., 2010) с применением модели нуклеотидных замен GTR+G+I. Для Байесовского построения (BI) было выполнено 2 независимых прогона с 4 цепочками Марковской цепи Монте-Карло (MCMC) одновременно проводился для 3 млн. поколений. Температура была эмпирически установлена на 0,2 и допускала выборку деревьев через каждые 500 поколений. Расчетный размер выборки (ESS) этого анализа превысил 500 для всех параметров. Итоговое среднее стандартное отклонение частот расщепления было ниже, чем 0,02. Потенциальный коэффициент уменьшения масштаба (PSRF) для всех параметров составил 1,00, что означает статистическое достижение сходимости цепочек MCMC. Первые 25% деревьев были отбракованы как “burn-in” и консенсусное дерево по правилу большинства 50% было оценено с учетом апостериорных вероятностей. Полученное дерево было визуализировано в программе FigTree v1.4.4. Скорость дивергенции между последовательностями изучали с помощью вычисления p-distance для 16S рРНК в MEGA 5.0 и результат использовали для расчета матрицы сходства по формуле [100x(1-p)] (в процентах). Среди штаммов морфологически близких к Leptolyngbya (трихомы однорядные, зелено-голубого цвета, покрытые тонким бесцветным чехлом, с недифференцированными клетками; ложного ветвления в культуре не наблюдалось, присутствует фрагментация нитей внутри трихома; клетки дисковидные или изодиаметрические; перетяжки слабо выражены; концевая клетка закругленная, без калиптр; средняя ширина клеток составляет 1,5±0,1 мкм, средняя длина – 0,9±0,1 мкм; соотношение длины к ширине 0,7:1) было выделено несколько. Среди них согласно BLAST-анализу секвенированных последовательностей гена 16S рРНК штамм П52 имеет максимальное сходство с Pseudophormidium sp. SIK74 (97,4%). Последний был ранее обнаружен в гиполитных сообществах пустыни Сахара (Mehda et al., 2021). Стоит отметить, что при ML/BI филогенетическом построении он кластеризуется с недавно выделенным в отдельный род Myxacorys составляющего сестринскую кладу к Leptolyngbya sensu stricto. Согласно литературным данным известно, что межвидовые отличия последовательности гена 16S рРНК у Myxacorys может варьировать в пределах 96–99% (Pietrasiak et al., 2019). Вычисленные нами p-distances для нашего штамма показали, что сходство его 16S рРНК с классическим представителем клады Leptolyngbya sensu stricto (L. boryana UTEX B 485) составляет 91,4%, в то время как между собой они сходны на 98,8–99,5%. Для M. californica и M. chilensis этот показатель варьирует в пределах 97,1–97,67% для четырех штаммов и сравнение с M. almedinensis показало 96,94%. P. americanum оказался сходен с нашим штаммом на 98,79%, при этом с видами Myxacorys получены значения от 97,16% до 98,61%. Анализ вторичной структуры петли D1-D1’ и B-box последовательностей 16S-23S ITS штамма Р52 и видов р. Myxacorys выявил его отличие как по количеству нуклеотидов, так и во вторичной структуре. Таким образом, основываясь на результатах проведенного анализа, было установлено сходство нового антарктического изолята как с M. chilensis, так и с P. americanum, что позволяет предложить, как ревизию ранее описанных таксонов, так и разработать новые критерии для их идентификации. |
