Molecular mechanisms of co-transcriptional gene silencing in the Drosophila piRNA pathway

Autor: Andreev, Veselin
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2022
DOI: 10.25365/thesis.71860
Popis: Transposons sind mobile genetische Elemente, die sich auf Kosten der Fitness des Wirtsgenoms vermehren. Angesichts der vielfältigen Herausforderungen, die Transposons für ihre Wirte darstellen, haben letztere verschiedene Strategien entwickelt, um der Transposon-Vermehrung entgegenzuwirken. Eine Art Verteidigungsstrategie basiert auf kleinen RNAs, welche von Argonaute-Effektorproteine gebunden werden und diese zu Ziel-Transkripten leiten, um posttranskriptionelles Gen-Silencing (PTGS) oder co-transkriptionelles Gen-Silencing (CTGS) zu bewirken. In Drosophila melanogaster legt der piRNA-Weg Transposons in den Gonaden sowohl auf der PTGS- als auch auf der CTGS-Ebene lahm. Während PTGS zur Zerstörung der Transposon-Transkripte führt, löst CTGS die Bildung von Heterochromatin am Transposon- Locus aus. Dadurch werden die schädlichen Transposons an ihrer Transkription gehindert. Zu Beginn meiner Doktorarbeit war bekannt, dass das Argonaut-Protein Piwi die Bildung von Heterochromatin an Transposon-Insertionen durch die Einbindung des Adaptorproteins Panoramix (Panx) steuert. Panoramix wiederum rekrutiert mittels unbekannter Mechanismen die zelluläre Heterochromatin-Maschinerie zu den von Piwi spezifizierten Zielen. Durch eine Kombination von Genreporter-Assays und biochemischen Experimenten konnte ich zeigen, dass ein amphipathisches Peptid mit einem zentralen LxxLL-Motiv in der N-terminalen ungefalteten Region (IDR) von Panx direkt mit dem allgemeinen Heterochromatinfaktor Small ovary (Sov) interagiert. Genetische Analysen ergaben, dass diese Interaktion für die Funktionalität des piRNA-Mechanismus essentiell ist. Biochemische und Sequenzanalysen von Sov ergaben das Vorhandensein von SUMO-interagierenden Motiven (SIMs), die die LxxLL-Bindedomäne direct flankieren und die mit der SUMOylierten Panx-IDR interagieren. Bemerkenswerterweise entdeckte ich, dass Piwi die SUMOylierung von Panx auf Chromatin stimuliert, was einen Regulierungsmechanismus darstellt, der die Interaktion zwischen Panx und Sov dort steuert, wo sie benötigt wird, nämlich an den von Piwi spezifizierten Zielloci. Insgesamt deckt meine Arbeit die Identität und Regulierung einer zentralen und direkten molekularen Schnittstelle auf, die den piRNA-Weg mit der zellulären Heterochromatin-Maschinerie verbindet.
Transposons are mobile genetic elements that propagate at the expense of host genome fitness. Given the unique challenges that transposons present to their hosts the latter have evolved multiple strategies to counter transposon proliferation. Small RNA-based pathways have evolved as one such defense strategy where Argonaute effector proteins are guided by their bound small RNAs in order to elicit post-transcriptional gene silencing (PTGS) or cotranscriptional gene silencing (CTGS). In Drosophila melanogaster the piRNA pathway operates in the gonads to suppress transposons at both the PTGS and CTGS levels. While PTGS results in the cleavage of target transposon transcripts, CTGS triggers the formation of heterochromatin at transposon loci, thereby limiting their deleterious effects through a reduction in their accessibility and transcriptional output. At the start of my PhD studies, it was known that the nuclear Argonaute Piwi orchestrates the formation of heterochromatin through the engagement of the adaptor protein Panoramix (Panx) that in turn directs the cellular heterochromatin machinery to Piwi- specified target loci. However, the molecular mechanisms of how Panx interacts with the heterochromatin machinery were not known. Through a combination of gene reporter assays and biochemical pulldowns I showed that an amphipathic LxxLL motif-containing peptide in the N- terminal intrinsically disordered region (IDR) of Panx directly interacts with the general heterochromatin factor Small ovary (Sov). Genetic analysis revealed that this interaction is essential for the functionality of the piRNA pathway. Biochemical and sequence analysis of Sov revealed the presence of SUMO-interacting motifs (SIMs), flanking its LxxLL-binding domain, which directly engage the Panx IDR following its SUMOylation. Remarkably I discovered that Piwi stimulates the SUMOylation of Panx on chromatin which provides a regulatory mechanism that controls the interaction between Panx and Sov where it is required, namely the Piwi- specified target loci. Altogether my work uncovers the identity and regulation of the first known direct molecular interface linking the piRNA pathway to the cellular heterochromatin machinery.
Databáze: OpenAIRE
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