Investigating the specificity of the Foot-and-mouth diesease leader protease using mutational analysis

Autor: Niemer, Melanie
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2010
DOI: 10.25365/thesis.12308
Popis: Der Maul-und-Klauenseuche-Virus (FMDV) gehört zur Familie der Picornaviridae. Diese umfasst kleine Viren ohne Lipidhülle, mit ikosaedrischem Kapsid sowie einem Genom positiver Polarität. Die Familie der Picronaviridae kann in zwölf verschiedene Genera unterteilt werden, welche sowohl für den Menschen als auch für Tiere wichtige Pathogene enthalten. Das RNA Genom besteht aus einem offenen Leserahmen von dem ein einziges Polyprotein abgelesen wird. Dieses wird anschließend von viralen Proteasen prozessiert. Die Papain-ähnliche Leader Protease (Lbpro) des Maul-und-Klauenseuche-Virus spaltet das Polyprotein zunächst zwischen dem eigenen C-terminus und dem N-terminus des strukturellen Proteins VP4. Es wurde gezeigt, dass diese Reaktion in cis (intramolekular) bevorzugt wird allerdings auch in trans (intermolekular) stattfinden kann. In vivo wird allerdings die intramolekulare Reaktion favorisiert. Neben dem viralen Polyprotein spaltet Lbpro die zwei Homologen des eukaryotischen Initiationsfaktor 4G (eIF4GI und eIF4GII) der Wirtszelle. eIF4G spielt eine zentrale Rolle während der Translationsinitation und sorgt als Verbindungsprotein für den Zusammenhalt der einzelnen Komponenten des Translationsinitationskomplexes. Sobald eIF4G von Lbpro gespalten wird, zerfällt dieser Komplex und die Wirtszelle kann keine gecappte mRNA zur 40S Untereinheit rekrutieren. Dadurch wird die Proteinsynthese der Wirtszelle verhindert. Die virale Translation hingegen ist nicht betroffen, da der Virus über ein sogenanntes internes ribosomales Eintrittssegment (IRES) initiiert. Infolgedessen übernimmt der Virus die Kontrolle über die Translationsmaschine der Wirtszelle. Lbpro ist eine Cysteinprotease mit einer stark eingeschränkten Substratspezifität, welche hauptsächlich von der S2 Tasche bestimmt wird. Ausschließlich Leucin, Valin sowie in gewissem Ausmaß werden an dieser Stelle akzeptiert. Die Sequenz bei der Lbpro das viral Polyprotein und eIF4GI spaltet enthält Leucin an dieser Stelle, wohingegen Valin diese Position in eIF4GII besetzt. Eine Konsensussequenz kann trotz dieser Übereinstimmung nicht festgelegt werden, da die einzelnen Sequenzen zu stark variieren. Vor Kurzem wurde gezeigt, dass eine weitere Aminosäure der hydrophobischen S2 Tasche äußerst wichtig ist für die Aufrechterhaltung der Spezifität von Lbpro. Molekulardesign und Mutationsanalysen ergaben, dass Leu143 ein wichtiger Faktor ist um Substrate welche Phenylalanin an Position P2 enthalten auszuschließen. Die Mutation Leu143Ala ermöglichte hingegen das Eindringen von Phenylalanin in die S2 Tasche. Folglich dürften sterische Hinderungen der Grund für die Diskriminierung von Phenylalanin sein. Die einzig andere Aminosäure die an der Position 143 in anderen FMDV Stämmen gefunden wurde ist nur Methionin. Demnach sind Leucin oder Methionin an Position 143 von biologischer Relevanz um jegliche Substrate mit Phe an Position P2 auszuschließen. Diese Diplomarbeit vergleicht die Substratspezifität des Wildtyps (Lbpro wt) mit der veränderten Spezifität von Lbpro L143A. Um den Unterschied aufzuzeigen wurde ein eIF4GII Fragment als Substrat verwendet. Dieses enthält sowohl die Lbpro Spaltsequenz als auch die eIF4E Bindungssequenz. Erwartungsgemäß wurden mit Lbpro wt nur zwei Spaltprodukte erhalten, wohingegen Lbpro L143A zusätzliche Spaltprodukte produziert. Eine Sequenz ähnlich jener die Lbpro in eIF4GII erkennt, wird allerdings nicht von Lbpro wt gespalten. Diese verwandte Sequenz wird aufgrund von Asp an Position P3 und Phe an Position P2 nicht erkannt. Da Lbpro L143A Phe an Position P2 akzeptieren kann, vermuteten wir, dass auch die ähnliche Sequenz geschnitten wird. Mittels Massenspektrometrie wurden zwei abweichende Spaltprodukte untersucht. Allerdings konnte nicht eindeutig bewiesen werden, dass Lbpro L143A diese Sequenz erkennt. Desweiteren wurde bei späteren Experimenten zusätzlich der eukaryotische Initiationsfaktor 4E (eIF4E) eingesetzt. eIF4E bindet einerseits zelluläre gecappte mRNAs, andererseits aber auch die N-terminale Region von eIF4G. Vorangehende Experimente haben gezeigt, dass eIF4G von einer ungeordneten in eine geordnete Konformation übergeht sobald es an eIF4E bindet. Dadurch wird die Region der Spaltung vermutlich stärker exponiert und ist für Lbpro leichter zugänglich. Dies wiederum sollte zu einer verbesserten Prozessierung durch Lbpro führen. Allerdings konnte bei meinem in vitro Versuchen keine Effizienzsteigerung durch den Zusatz von eIF4E zu eIF4G und anschließender Zugabe der Protease beobachtet werden. Abgesehen von eIF4GII wurde ein weiteres Substrat verwendet, nämlich eIF4GIIself. eIF4GIIself enthält die Selbstprozessierungssequenz von Lbpro statt der natürlichen Spaltungssequenz. Obwohl die chemische Umgebung in eIF4GII eine andere ist als jene im viralen Polyprotein, schneiden beide Proteasen (Lbpro wt und Lbpro L143A) die Selbstprozessierungssequenz. Überdies werden 50% eIF4GIIself bereits bei einer geringeren Menge an Protease geschnitten als eIF4GII. Folgedessen könnte man annehmen, dass Lbpro die Selbstprozessierungssequenz mit größerer Effizienz erkannt wird als die natürliche Sequenz in eIF4GII.
Foot-and-mouth disease virus (FMDV) is a member of the picornavirus family, consisting of small non-enveloped icosahedral viruses with an RNA genome of positive sense. The family contains twelve different genera, including important human and animal pathogens. The RNA genome encodes one large open reading frame from which a single polyprotein is translated. This single polyprotein is processed by viral proteases resulting in mature viral proteins. The papain-like leader protease (Lbpro) of FMDV performs the initial cleavage on the polyprotein between its own C-terminus and the N-terminus of the structural protein VP4. This cleavage has been shown to be favored in cis (intramolecular), although also trans (intermolecular) cleavage is observed in vitro. However, intramolecular processing is preferred in vivo. The only other substrates cleaved by Lbpro besides the viral polyprotein are the two homologues of the host cell eukaryotic translation initiation factor 4G (eIF4GI and eIF4GII). eIF4G is crucial for translation initiation acting as a scaffold and bringing the components of the translation initiation complex in close proximity. Once eIF4G is cleaved by Lbpro, it loses this property. Consequently, the protein synthesis of the cell is inhibited as the recruitment of capped mRNAs to the 40S ribosomal subunit is no longer possible. However, viral translation is unaffected as it initiates via an internal ribosomal entry segment (IRES) present on the 5’ untranslated region of the viral genome. Therefore, the virus is still able to exploit the host cell translation machinery. Lbpro is a cysteine protease with a very narrow substrate specificity mainly determined by the S2 pocket. Only leucine, valine and, to a certain extent, isoleucine are accepted at this site. The cleaved sequences on the viral polyprotein and eIF4GI both contain leucine at S2, whereas valine occupies this position in eIF4GII. Despite these constraints, no consensus sequence can be determined as the sites differ strongly from each other. Recently, it has been shown that especially one residue involved in the formation of the hydrophobic S2 pocket is of great importance for the maintenance of the proteases specificity. Molecular modeling and mutational analysis demonstrated that Leu143 is able to discriminate a substrate containing phenylalanine at the P2 position. Thus, a Leu143Ala variant of Lbpro was able to accept phenylalanine. Therefore, sterical hindrances caused by leucine might be the reason for this discrimination. The only other residue found at position 143 in Lbpro of different FMDV strains is methionine. Hence, the presence of either leucine or methionine at position 143 of Lbpro is crucial for the high specificity of the protease. Furthermore, the ability to cleave substrates containing phenylalanine at P2 seems to be of biological relevance for the virus. This thesis compares the substrate specificity of Lbpro wt with the altered specificity of Lbpro L143A. To demonstrate the change in specificity, an eIF4GII fragment containing the Lbpro and eIF4E binding sequence was used as substrate. As expected, Lbpro wt generated only two cleavage products whereas Lbpro L143A produced additional cleavage products. A sequence related to the cleavage sequence of Lbpro on eIF4GII is not recognized by Lbpro wt due to the presence of aspartic acid at P3 and phenylalanine at P2. As Lbpro L143A was shown to accept phenylalanine at P2, we speculated that this related sequence might be cleaved as well. However, mass spectrometry analysis of two aberrant cleavage products gave no explicit indication that this sequence is indeed recognized. Further investigations on the specificity included the eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E). eIF4E binds capped cellular mRNAs and the N-terminal region of eIF4G. Previous experiments demonstrated that upon binding of eIF4E, eIF4G undergoes an unfolded-to-folded transition. As a result, the eIF4G cleavage sequence is exposed and becomes better accessible for Lbpro enhancing the cleavage efficiency. However, in our in vitro approach adding different amounts of eIF4E to eIF4GII prior to cleavage did not change the efficiency of cleavage by Lbpro wt or Lbpro L143A. In a last set of experiments, a second substrate, eIF4GIIself, was used. In eIF4GIIself the natural cleavage sequence is exchanged with the Lbpro self-processing site. Despite the different chemical environment in eIF4GII than found in the viral polyprotein, Lbpro wt and Lbpro L143A were able to process eIF4GIIself. Furthermore, a lower amount of protease was needed to process 50% of eIF4GIIself compared to eIF4GII. These findings suggest that the self-processing sequence is, in spite of the changed chemical environment better recognized by Lbpro than the natural sequence of eIF4GII.
Databáze: OpenAIRE
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