Novel 3D-printed cell culture inserts for advanced in vitro skin regeneration

Autor: Bauer, Magdalena
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2021
DOI: 10.25365/thesis.70853
Popis: Unsere Haut ist das größte und eines der komplexesten Organe des menschlichen Körpers. Da 2D Monolayer Kulturen stark vom physiologischen Verhalten abweichen, werden häufig Tiermodelle eingesetzt, um die Funktion gesunder und kranker menschlicher Haut zu untersuchen. Im Sinne der 3Rs (Replacement, Reduction, und Refinement) werden 3D Hautequivalente genutzt, um die Lücke zwischen Tiermodell und Monolayer Kultur zu schließen. Diese Hautäquivalente werden entweder teuer gekauft oder selbst im Labor auf gekauften Inserts gezüchtet. Ziel dieser Arbeit ist es, solche Inserts mittels 3D Druck herzustellen, um in ihnen „full thickness“ Hautäquivalente zu züchten und die Hautbarrierefunktion zu testen. Dazu wurde ein computergestütztes Designmodell erstellt und mittels extrusionsbasiertem 3D Druck von Polymilchsäure (PLA) Filament realisiert. Das PLA wurde hinsichtlich Zytotoxizität gemäß ISO 10993-5 bewertet. Weiteres wurden „full thickness“ Hautäquivalente mit einer humanen Fibroblastenzelllinie und humanen epidermalen Hautkeratinozyten auf einem Kollagen/Fibrin Gel hergestellt. Um die Hautbarriere zu untersuchen, wurde eine quantitative Fluoreszenzmessung von Fluoreszenzfarbstoffen durchgeführt. Von der initialen Konstruktion, bis zur finalen funktionstüchtigen Version wurden sechs Konstruktionsvarianten durchlaufen. Zellkulturexperimente zeigten erfolgreich, dass es technisch möglich war, „full thickness“ Hautäquivalente auf den hauseigenen 3D gedruckten Inserts zu erzeugen. PLA zeigte in der MTT-Analyse keine Anzeichen für Zytotoxizität. Hautbarrierefunktionuntersuchungen mittels Fluoreszenzmessungen von Riboflavin und Alexa Flour® gaben erste Hinweise für die Verwendbarkeit des 3D gedruckten Systems. Mit dieser Arbeit wird ein Puzzlestück zur Verfügbarkeit von 3D Hautmodellen in Forschungslaboren hinzugefügt. Das System ist variabel in Druckmaterial, Membranmaterial sowie in der Größe. Darüber hinaus ist es mit gängigen Zellkulturplatten kompatibel, kostengünstig und einfach in der Handhabung.
In skin research, 2D monolayer in vitro models provide only limited fields of application as they do not sufficiently mimic physiological properties, like functional skin barrier (SB). Since in the spirit of 3R’s (Replacement, Reduction, and Refinement) animal models are to be avoided, new approaches like 3D skin equivalents (SE) are needed to close the in vitro/in vivo gap. Cell culture inserts for the production of SE are commercially available, however, these inserts are expensive and limited regarding the experimental setup. This work aimed to establish and evaluate novel lab-based 3D printed cell culture inserts for full thickness SE generation. A computer-aided design model was realized with extrusion-based 3D printing of polylactic acid (PLA) filament. While improving the insert, we went through six construction versions. PLA printing material was evaluated regarding cytotoxicity according to ISO 10993-5 and nanoparticle analysis. No objections were found. In a next step, a full thickness SE was created on a collagen/fibrin dermal scaffold. Cell culture experiments successfully demonstrate that it is technically possible to generate SE on the in-house inserts. SB was tested by performing skin permeability assays. Here, the diffusion of fluorescent dyes was quantified. First measurements using Riboflavin and Alexa Flour® indicate the very good performance of the 3D printed system. This work provides valuable know-how for the generation of SE, as well as testing the SB in-house. The system is accessible to everyone with a 3D printer, variable in printing material, compatible to commonly used cell culture plates, very cost-effective and easy to handle.
Databáze: OpenAIRE
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