Агробактериальная трансформация культуры клеток василистника малого (Thalictrum minus L. )
| Rok vydání: | 2018 |
|---|---|
| Předmět: | |
| DOI: | 10.24411/1990-5378-2018-00116 |
| Popis: | Разработан метод агробактериальной трансформации каллусной культуры клеток лекарственного растения василистник малый. Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tumefaciens, содержащей коинтегративный вектор pGV 3850. Плазмида содержит целевой ген ipt, кодирующий ключевой фермент биосинтеза цитокининов изопентенилтрансферазу, под промотором 35S вируса мозайки цветной капусты и селективный ген nptII, кодирующий фермент неомицинфосфотрансферазу, придающий устойчивость к канамицину, под контролем NOS промотора. Трансформировали два штамма «В» и 233, различающихся по интенсивности роста и уровню биосинтеза протобербериновых алкалоидов. Оценивали эффективность влияния на трансформацию вакуумной инфильтрации и экстракта табака. Отбор трансформированных каллусов проводили на сублетальной концентрации канамицина: для штамма «В» 50 мг/л и штамма 233 20 мг/л. Устойчивые к канамицину клеточные линии оценивали методом ПЦР на наличие в них гена ipt. Отмечена отдаленная реакция на канамицин, то есть снижение жизнеспособности каллусов при отсутствии канамицина происходило к третьему пассажу. Наиболее низкая выживаемость каллусов отмечена в варианте с экстрактом табака. Однако методом ПЦР показано, что наиболее эффективным для трансформации был вариант с экстрактом табака без вакуумной инфильтрации. В результате были выделены ipt-положительные клеточные линии: пять клеточных линий из штамма 233 и одна клеточная линия из штамма «В». Эффективность трансформации (отбор на канамицине + ПЦР) для штамма 233 составила 14,6%, для штамма «В» 0,1%. Из пяти ipt-положительных линий от штамма 233 две из них имели более высокую интенсивность роста и уровень содержания протобербериновых алкалоидов, единственная ipt-положительная линия от «В» штамма имела, наоборот, более низкую интенсивность роста и низкий уровень протобербериновых алкалоидов. Cреди ipt-положительных линий отмечена вариабельность по интенсивности роста и уровню биосинтеза протобербериновых алкалоидов. Developed a method of Agrobacterium-mediated transformation of callus culture cells of medicinal plants Thalictrum minus. Agrobacterium tumefaciens strain containing cointegrable vector pGV 3850 was used for the transformation. The plasmid contains the target ipt gene encoding the key cytokinin biosynthesis enzyme isopentenyltransferase, under the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus, and the selective npt II gene encoding the neomycin phosphotransferase enzyme conferring kanamycin resistance under the control of the NOS promoter. Two strains, «B» and 233, which differ in their growth intensity and in the level of biosynthesis of the protoberberine alkaloids, were transformed. The effectiveness of the influence on the transformation of vacuum infiltration and tobacco extract was evaluated. Selection of transformed calli was carried out at a sublethal concentration of kanamycin, which is different for different strains, for the initial strain «B» 50 mg / l, for strain 233 -20 mg / l. Further evaluation of the transformation was carried out by PCR. High callus stability after transformation on kanamycin in both strains is shown. A distant reaction to kanamycin was noted, that is, a decrease in the viability of calli in the absence of kanamycin occurred at the third passage. The lowest survivability of calli was noted in the version with tobacco extract. However, the PCR method showed that the most effective variant of transformation was only tobacco extract without vacuum infiltration. As a result, ipt-positive five lines from strain 233 and one line from strain «B» were isolated. The transformation efficiency (selection on kanamycin + PCR) for strain 233 was 14.6%, for strain «B» 0.1%. Of the five ipt-positive lines from strain 233, two of them had a higher growth rate and a level of content of protoberberine alkaloids, the only ipt-positive line from strain «B» had, on the contrary, a lower growth rate and a low level of protberberine alkaloids. Among the ipt-positive lines, the variability in growth intensity and the level of biosynthesis of the protoberberine alkaloids. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
|