| Popis: |
Продукция бактериоцинов клиническими штаммами стафилококков может играть существенную роль в бактериальной колонизации госпитальных пространств. Важнейшим инструментом этого процесса является секреция в окружающую среду низкомолекулярных катионных пептидных соединений, обладающих, как правило, широким спектром ингибирующего действия, как в отношении близкородственных видов, так и представителей других родов грамположительных бактерий [1]. В настоящее время представляется, что бактериоциногения коагулазонегативных стафилококков является широко распространенным явлением [2]. Цель работы – изучение распространенности феномена продукции низкомолекулярных антибактериальных соединений пептидной природы среди клинических штаммов коагулазонегативных стафилококков. За период с 2005 по 2020 гг. было исследовано 9952 штамма коагулазонегативных стафилококков (КНС), выделенных в бактериологической лаборатории МУЗ Городская клиническая больница № 7 г. Перми с различных объектов родильных стационаров. Идентификацию стафилококков проводили с использованием набора StaphyTest 24 (Чехия). Для выявления антибактериальной активности (АБА) КНС, их выращивали на жидкой обогащенной питательной среде [3] при 37 оС с аэрацией в течение 15–18 ч. Клетки осаждали, надосадочные жидкости стерилизовали ультрафильтрацей и исследовали их АБА методом диффузии в агарозу. В расплавленную и охлажденную до 42 оС агаризованную среду вносили суспензию тест-бактерий S. cohnii ВКМ-3165 (105 КОЕ/мл), распределяли в чашке Петри. На поверхность агарозного слоя наносили по 5 мкл исследуемых ультрафильтратов сред роста КНС, подсушивали и инкубировали при 37 оС 16−18 ч. О наличии АБА судили по формированию зон подавления роста в местах аппликации культуральных жидкостей. Количественный анализ АБА проводили с помощью метода двукратных серийных разведений. За условную единицу (ЕА) АБА принимали обратную величину максимального разведения, при котором наблюдалось полное торможение роста тест-бактерий. Природу АБА устанавливали с помощью обработки ультрафильтратов сред культивирования КНС, обладающих АБА различными гидролазами [3]. Для выделения бактериоцинов использовали ионообменную хроматографию [3]. Масс-спектрометрический анализ пептидного состава проводили на Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation (Perseptive Biosystems). За период проведения скрининга на способность к продукции антибактериальных соединений антагонистическая активность по отношению к тест-бактериям S. cohnii ВКМ-3165 была выявлена у представителей 209 штаммов КНС. Таким образом, нами было показано, что среди госпитальных изолятов КНС более 2% обладают способностью к продукции антибактериальных соединений. Путем протеолитической обработки полученных ультрафильтратов сред культивирования бактерий-продуцентов установлено, что АБА полностью исчезает после воздействия трипсином и протеиназой К и снижается в 2–4 раза после действия пепсина. Обработка ультрафильтратов ДНКазой и РНКазой не оказывала влияния на их АБА. Следовательно, выявляемая АБА обусловлена соединениями пептидной природы. Биохимическая идентификация 30 продуцентов с АБА культуральных жидкостей более 256 ЕА показала, что 12 штаммов принадлежали виду S. warneri, 11 штаммов – S. cohnii, 5 штаммов – S. haemolyticus и по 1 штамму видов S. epidermidis и S. hominis. Выделенные фракции антибактериальных пептидов трёх штаммов S. haemolyticus 117, S. hominis KLP-1 [4] и S. warneri 1535 были исследованы с помощью масс-спектроскопического анализа. Было показано, что антибактериальный пептид бактерий S. haemolyticus 117 обладает мол. массой 3004,7 Dа, хоминин [5] имеет массу 2985 Dа, а пептид S. warneri 1535–2998 Da (рис.). Таким образом, показано, что среди исследованных штаммов КНС более 2% являются продуцентами антибактериальных соединений. Антибактериальная активность этих стафилококков обусловлена выделением в среду роста низкомолекулярных пептидных соединений, подавляющих развитие близкородственной микрофлоры. Развитие бактерий с высокой антагонистической активностью, вероятно, способствует их распространению и доминированию в полимикробной среде. |
