| Popis: |
Гидролазы (EC 3) представляют собой один из классов ферментов, осуществляющих биохимические реакции расщепления молекул биополимеров (белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты) до соответствующих мономеров при участии молекул воды [1], они обнаружены у всех живых организмов, включая бактерии. В последнее время интерес к бактериальным гидролитическим ферментам со стороны исследователей значительно возрос в связи с уже доказанной их ролью у многих патогенов в процессах метаболизма, споруляции, генерации межклеточных сигналов – запуску так называемой системы «Quorum sensing», приводящей к образованию биоплёнок в ответ на изменение среды, активации систем секреции, запуску каскадных механизмов процессов фибринолиза и протеолиза при проникновении в организм хозяина и действии на клетки-мишени [2].У Vibrio cholerae обнаружено и охарактеризовано несколько протеаз [3], у Francisella tularensis имеются сообщения о наличии липолитической активности [4], выявлении мембрансвязанных протеаз [5], детекции вирулент-ассоциированной сериновой гидролазы [6]. Однако на настоящий момент времени отсутствует в литературе полная информация о всех имеющихся гидролитических ферментах V. cholerae O1 и O139 серогрупп и F. tularensis разных подвидов, нет их сравнительной характеристики и группировки по связи с патогенностью/вирулентностью и адаптацией/персистенцией штаммов этих микроорганизмов в связи с весьма вероятной ролью ферментов в этих процессах. Всё это определяет важность изучения гидролаз как дополнительных факторов патогенности, персистенции и адаптации у таких представителей ООИ как V. cholerae и F. tularensis разной эпидемической значимости и происхождения.Одним из высокочувствительных, высокоспецифичных, хорошо воспроизводимых и наглядных методик обнаружения и полуколичественного анализа продуктов гидролиза гидролитических ферментов является прямая зимография в полиакриламидном геле [7].В связи с чем она была выбрана ввиду её конкурентных преимуществ по сравнению с другими энзимологическими методами – она позволяет наглядно и в течение короткого времени определить состав, спектр и свойства, оценить мол. массу обнаруженных гидролитических ферментов, относящихся к разным подклассам.Основной задачей работы явилось выявление наличия, состава и сравнительное изучение некоторых свойств гидролитических ферментов разных подклассов у V. cholerae O1 и O139 серогрупп и F. tularensis разных подвидов.Объектами для исследования стали препараты субклеточных фракций V. cholerae O1 и O139 серогрупп и F. tularensis разных подвидов, супернатанты культуральной жидкости холерного вибриона (выборка n = 40). Субклеточные фракции холерных вибрионов и туляремийного микроба получали по методу [8]. Супернатанты культуральной жидкости получали из бакмассы V. cholerae, выращенной в течение суток на МПБ при 37 °С при pH 7,8 и помещённой во флаконы с МПБ. После двухчасовой инкубации во флаконы с МПБ добавляли мертиолят натрия в концентрации 0,01% и инкубировали в течение двух суток на холоду. После прохождения контроля специфической стерильности материал центрифугировали, супернатант диализовали и лиофилизировали. Зимографию осуществляли электрофорезом в 8% ПААГ, сополимеризованном с желатином, казеином, человеческим IgG, фибрином, муцином, пептидогликаном, карбоксиметилцеллюлозой, коллоидным хитином и гликольхитозаном, импрегнированных в полиакриламидный гель в 0,1% конечной концентрации. О наличии активности ферментов судили по образованию бесцветных полос на фоне окрашенных Coomassie R-250, Amidoblack 10B, Alcian Blue полиакриламидных гелей.Достоверно установлено, что большинство препаратов субклеточных фракций V. cholerae O1 и O139 серогрупп и F. tularensis разных подвидов имеет в своём составе полипептиды, обладающие протеазной, казеиназной, IgG-деградирующей, фибринолитической, муциназной, нуклеазной, пептидогликангидролазной, липолитической, лецитиназной, карбоксиметилцеллюлазной и хитинолитической активностями. При этом отмечены различия в продукции тех или иных гидролаз в зависимости от эпидзначимости исходных штаммов: у нетоксигенных водных штаммов V. cholerae больше экстрацеллюлярных протеаз (восемь протеаз), семь IgG-протеаз, шесть карбоксиметилцеллюлаз, хитиназ (девять хитиназ), лежащих в высоко и средне молекулярных (от 120 до 60 кДа) зонах геля, у препаратов субклеточных фракций холерного вибриона обнаружено пять хитозаназ, в то время как у препаратов из токсигенных штаммов наблюдается большее количество муциназ (шесть), семь РНКаз, три лецитиназы с мол. массой 80, 90 и 120 кДа, восемь липаз, а у нетоксигенных от одной до двух липаз в зависимости от штамма. У препаратов субклеточных фракций туляремийного микроба больше всего протеаз и карбоксиметилцеллюлаз обнаруживается у авирулентных штаммов, в то время как у вирулентных преобладает количество хитиназ (семь), липаз (четыре) с мол. массами 50, 70, 90, и 110 кДа, фибринолитических протеаз (пять), и IgG-протеаз, с мол. массами 65, 75, 80 и 120 кДа. Обнаруженная высокая активность протеаз, хитиназ и пептидогликангидролаз у нетоксигенных штаммов V. cholerae свидетельствует об их вкладе в адаптационный (персистентный) потенциал этих штаммов, более высокая активность муциназ, липаз, лецитиназ, РНКаз у токсигенных может указывать на их роль в патогенности возбудителя. Более высокая продукция протеаз и карбоксиметилцеллюлаз у авирулентных F. tularensis может указывать на их роль в адаптации, и соответственно преобладание хитиназ, липаз IgG-протеаз у вирулентных свидетельствует об их возможной роли в патогенезе туляремийной инфекции.Таким образом, с помощью субстратного электрофореза в ПААГ выявлены достоверные количественные и качественные различия в спектре бактериальных гидролитических ферментов, относящихся к разным подклассам у разных по патогенности (вирулентности) штаммам. Это предоставляет возможность косвенно оценивать их адаптационный и патогенный потенциалы, что определяет дальнейшие перспективы этого метода для микробиологической диагностики этих инфекций. |
