| Popis: |
Ферменты эндоглюканазы, а именно ксиланазы и целлюлазы, широко используются в разных отраслях промышленности: пищевой, целлюлозно-бумажной, легкой. При этом они являются сложными для получения, так как при гетерологичной наработке часто агрегируют. Цель данной работы: амплификация генов ксиланазы и целлюлазы (номера аминокислотных последовательностей в базе данных NCBI: WP_189896010 и WP_189902393.1, соответственно) из штамма Streptomyces spiralis ВКМ Ас-1311. Из штамма Streptomyces spiralis ВКМ Ас-1311 была выделена геномная ДНК с использованием коммерческого набора QIAamp® DNA Mini Kit согласно инструкции производителя (Qiagen, Нидерланды). Выделенную геномную ДНК хранили при –20 °C. С помощью программы IDT OligoAnalyzer™ Tool были написаны праймеры для амплификации генов ксиланазы и целлюлазы. Праймеры были проверены на отсутствие шпилек и димеризации. Были определены теоретические температуры отжига этих праймеров (S.sp.1F – 54,6 °C; S.sp.1R – 52,8 °C; S.sp.7F – 56,3 °C; S.sp.7R – 59,3 °C) Была осуществлена ПЦР-амплификация генов ксиланазы и целлюлазы. Электрофорез продуктов ПЦР-амплификации представлен на рис. 1. Условия ПЦР-амплификации были следующие: 1. Начальная денатурация – 95 °C 5 мин; 2. 35 циклов: денатурация – 95 °C 30 с; отжиг праймеров: для ксиланазы – 55 °C 30 с, для целлюлазы – 51 °C 30 с; 3. Элонгация – 72 °C 1 мин 40 с; финальная элонгация – 72 °C 2 мин. Электрофорез в агарозном геле показал, что условия для наработки гена целлюлазы оказались не подходящими. Поэтому для постановки ПЦР использовали разные сочетания полимераз и буферов (от разных производителей). Наиболее успешным для наработки гена целлюлазы было сочетание Taq-полимеразы фирмы Диаэм (Россия) и GC-богатого буфера компании Thermo Fisher Scientific (США) (рис. 2). Был произведен препаративный электрофорез полученных ампликонов, продукты были очищены и переданы на секвенирование. Анализ сиквенса генов ксиланазы и целлюлазы подтвердил, что были амплифицированы интересующие нас гены. Были написаны экспрессионные праймеры для клонирования генов ксиланазы и целлюлазы в бактериальный вектор pQE-30. |
