Synthesis and evaluation of water-soluble ABAO-assay substrates for application in FADS

Autor: Schiefer, Astrid
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2021
Předmět:
DOI: 10.34726/hss.2021.95361
Popis: Aldehyde finden in den unterschiedlichsten Industriezweigen Einsatz. So werden Aldehyde unter anderem in der Lebensmittel-, Geschmacks- und Duftstoffindustrie verwendet sowie beispielsweise in der Produktion von Biotreibstoffen und Arzneimittel. Neben der chemischen Synthese von Aldehyden k��nnen diese auch enzymatisch gewonnen werden. Eine M��glichkeit, die ��ber die letzten Jahre Interesse geweckt hat, ist die Verwendung von Carbons��ure-Reduktasen (CARs). Diese NADPH- und ATP-abh��ngigen Enzyme k��nnen Carbons��uren in die entsprechenden Aldehyde ��berf��hren. Die Vielzahl an m��glichen Substraten sowie der nachhaltige Produktionsweg durch die Verwendung von Enzymen machen den Einsatz von CARs in der Industrie interessant. F��r den industriellen Einsatz ist es jedoch oft unerl��sslich, die Eigenschaften des Enzyms, wie die thermische Stabilit��t, die Substratspezifit��t, die Produktivit��t usw., zu optimieren. Eine Variante, dies zu erreichen, ist die Ver��nderung des Enzymes via gerichtete Evolution.5Um die gro��en Mutanten-Bibliotheken des gerichteten Evolution-Experiments screenen zu k��nnen, sind Screeningmethoden mit einem hohen Durchsatz vorteilhaft. In unserem Fall ist angedacht, das mikrofluidische flurorescence-activated droplet sorting (FADS) System f��r das Screenen nach CARs mit verbesserten Eigenschaften einzusetzen. Bei dieser Methode werden einzelne Zellen, die jeweils eine Enzymvariante exprimieren, in einen Wassertropfen auf einem Mikrochip eingeschlossen. Diese Tropfen dienen als ���Reaktionsgef������� und sorgen f��r eine Verkn��pfung des Genotyps mit dem Ph��notyp. Die Detektion von den optimalen Mutanten basiert auf dem Auftreten eines Fluoreszenzsignals. Ein Assay wird angewendet und sorgt f��r ein Fluoreszenzsignal, sofern das Enzym die gew��nschte Eigenschaft besitzt.7In unserem Fall soll eine Zelle, die eine CAR Variante exprimiert, und eine Carbons��ure als Substrat in den Tropfen eingeschlossen werden. Um die entstehenden Aldehyde nachzuweisen, ist die Verwendung des ABAO-Assays geplant. Dieser erm��glicht die Detektion und Quantifizierung von Aldehyden. Dazu wird neben der Zelle und dem Substrat auch noch das Reagenz 2-Aminobenzamidoxim (ABAO) in den Tropfen eingeschlossen. Dieses reagiert mit dem gebildeten Aldehyd und bildet ein Chinazolin, das fluoresziert. Basierend auf diesem Fluoreszenzsignal erfolgt dann die Sortierung der Tropfen auf dem Mikrochip.Eine wichtiger Aspekt ist es, sicherzustellen, dass keine Komponenten aus dem Tropfen in die ��lphase bzw. in einen anderen Tropfen diffundieren. Da damit gerechnet wird, dass das ��blicherweise eingesetzte ABAO bzw. das Derivat MeO-ABAO nicht hydrophil genug ist, um ausreichend lang im Tropfen zu verbleiben, wurde die Verwendung anderer ABAO-Derivate angedacht. Diese neuen ABAO Substrate sowie das ABAO und MeO-ABAO sind in Scheme 2 zu sehen. Die ��berlegung ist, dass durch Anbringen einer polaren Gruppe, wie einer quart��ren Ammonium- oder einer Phosphonogruppe, eine h��here Hydrophilie und damit l��ngere Verweilzeit im Tropfen erreicht werden kann. In diesem Kontext ist das Thema dieser Arbeit die Optimierung der Synthese des P-MeO-ABAO. Um zu ermitteln, ob auch dieses neue Substrat f��r den Assay geeignet ist, wurden au��erdem logD-Bestimmungen und Fluoreszenzmessungen durchgef��hrt. Zudem werden drei Syntheseans��tze f��r das Ammonium-MeO-ABAO beschrieben. Das finale Ammonium-MeO-ABAO wurde zwar nicht erhalten, jedoch werden die unterschiedlichen Routen diskutiert, um einen Anhaltspunkt f��r zuk��nftige Synthesen zu liefern.
Aldehydes are a very versatile compound class that is utilized in various application fields. Besides playing an essential role in the food, flavor, and fragrance industry, aldehydes are also used as building blocks for biofuel or drug production. Apart from synthetic-chemical approaches, aldehydes can also be obtained by enzymatic reactions. Among the enzymes that yield aldehydes as products, the enzyme class of carboxylic acid reductases (CARs) has gained interest over the last few years. The NADPH- and ATP-dependent CARs can convert carboxylic acids to aldehydes. The broad substrate scope and sustainability make the industrial application of CARs attractive. However, the enzyme���s properties like stability, substrate specificity, productivity, etc., need to be optimized for use in the industry. One way how this can be accomplished is by directed evolution. For the screening of the large mutant libraries of the directed evolution experiments, a high-throughput screening method is advantageous. In our case, it is intended to use the microfluidic fluorescence-activated droplet sorting system (FADS) for this task. It is based on encapsulating single cells that express an enzyme variant in aqueous droplets on a microfluidic chip. These droplets are used as ���reaction vessels��� and link the genotype with the phenotype. The detection of the improved enzyme variants by FADS is based on an assay that connects the property of interest with a fluorescence signal. In our case, we would like to encapsulate a carboxylic acid as the substrate with a single cell expressing a CAR mutant. As we would like to screen for aldehyde-producing enzymes, the idea is to use the so-called ABAO-assay. This assay allows the detection and quantification of aldehydes. The co-encapsulated 2-aminobenzamidoxime (ABAO) undergoes a reaction with the produced aldehyde, and a quinazoline is formed, which shows fluorescence emission after excitation by a laser. Based on the fluorescence signal, the droplets are sorted accordingly.One challenge of using the FADS system is ensuring that no encapsulated compounds are transferred into the oil or other droplets. As it is believed that the usually applied ABAO or derivative MeO-ABAO are not hydrophilic enough to remain inside the aqueous droplets for a sufficient time, other ABAO-derivatives were contrived. These new ABAO substrates, the P-MeO-ABAO and the Ammonium-MeO-ABAO.The idea is that higher hydrophilicity - and therefore longer dwelling time inside the droplets- is obtained by adding the polar phosphono and the quaternary ammonium group to the MeO-ABAO framework. In this regard, this diploma thesis deals with optimizing a synthetic route for the P-MeO-ABAO, the compound���s logD determination, and fluorescence measurements to see if the assay is still feasible with this new substrate. Furthermore, three different attempts for synthesizing the Ammonium-MeO-ABAO are described. Although the final Ammonium-MeO-ABAO could not be obtained, the gained insights are discussed to serve as a starting point for further syntheses.
Databáze: OpenAIRE
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