| Popis: |
Актуальность. Одним из путей совершенствования методологии лабораторного контроля за генно-инженерно-модифицированными организмами растительного происхождения (ГМО) является использование мультиплексирования – подхода, который позволяет увеличить число определяемых мишеней и повысить количество одномоментно обрабатываемых образцов, максимально реализуя потенциал полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). Цель исследования – разработка протокола количественного определения генно-инженерно-модифицированного (ГМ) картофеля линии AV43-6-G7 в формате дуплексной ПЦР-РВ по технологии TaqMan® PCR. Материал и методы. Дуплексная система включала 2 вида специфических ДНК-праймеров и флуоресцентно-меченных зондов: первый – для выявления специфичной трансформационному событию AV43-6-G7 последовательности ДНК, второй – для выявления таксон-специфичного гена картофеля Stp23. Параметры ПЦР выбирали путем эмпирического подбора концентраций праймеров и зондов, ионов Mg2+, дезоксирибонуклеотидов, стабилизирующего агента для полимеразы, температуры отжига праймеров и продолжительности инкубации для каждой стадии цикла. Результаты. В результате исследований был оптимизирован состав реакционной смеси для обнаружения и количественного определения ГМ-картофеля линии AV43-6-G7 в продовольственном сырье и пищевых продуктах. Подобраны олигонуклеотидные праймеры, флуоресцентные зонды. Апробированы составы реакционных смесей и температурно-временные параметры ПЦР: 2,5-кратный реакционный буфер для проведения ПЦР-РВ в присутствии ROX (carboxy-Xrhodamine), праймеры, специфичные для ГМ-компонента (AV43-6-G7-f/AV43-6G7-r) и целевого таксона (GРF3/GРR3) в количестве 300 нM/300 нM и 100 нM/ 100 нM, зонды – 200 нM и 200 нM соответственно; бычий сывороточный альбумин – 0,04%; MgCl2 – 3,5 мМ, дезоксинуклеозидтрифосфаты – 0,3 мМ, а также температурно-временной профиль реакции (начальная денатурация 95 °С – 5 мин, последующие 45 циклов: 95 °С – 20 с, 58 °С – 20 с, 62 °С – 40 с). Заключение. Валидность разработанного метода подтверждена лабораторными исследованиями и свидетельствует о его надежности. |
