| Popis: |
Окислительный стресс (ОС) является результатом воздействия на организмы активных форм кислорода (АФК). Эти активные формы кислорода оказывают токсическое и мутагенное действие на все виды клеток вследствие окислительного повреждения мембранных липидов, белков и ДНК. В ходе эволюции бактерии, как и другие организмы, выработали механизмы защиты клеток от различных типов окислительного стресса. При воздействии на бактерии Escherichia coli пероксида водорода адаптивный ответ связан с индуцированным синтезом большого числа белков, часть которых находится под контролем гена oxyR. Предполагается, что ОС может возникать при стрессах, не связанных с прямым воздействием АФК. Было показано, что в аэробных условиях ряд антибиотиков может стимулировать продукцию АФК, которые вносят вклад в бактерицидное действие этих соединений (Kohanski et al., 2007, DOI: 10.1016/j.cell.2007.06.049). Позднее появились работы другой исследовательской группы, в которых представлены аргументы против АФК-опосредованного киллинга бактерий антибиотиками (Liu, Imlay, 2013, DOI: 10.1126/science.1232751). Следует отметить, что этот случай не единственный пример противоречивых результатов, относящихся к изучению ответа бактерий на стрессы. Источниками расхождений в результатах могут быть такие факторы как использование разных питательных сред, условий культивирования и способов отбора проб, а также отсутствие контроля за изменениями таких физико-химических параметров среды как рН, Eh, содержание кислорода и ионного ионный состав. Одним из способов решения этой проблемы может быть применение разработанной нами системы непрерывной и синхронной регистрации этих и других параметров с применением электрохимических сенсоров непосредственно в колбах с культурами бактерий. Этот комплекс позволяет отследить изменения параметров, происходящие в течение нескольких секунд без отбора биоматериала, непосредственно в бактериальной культуре.В настоящей работе с помощью электрохимических сенсоров исследовался ранний ответ аэробно растущих бактерий E. coli BW25113 на пероксидный стресс, индуцируемый добавлением 2 mM H2O2 в середине экспоненциальной фазы роста. Бактерии культивировали на среде М9 с 0,15% глюкозы в термостатируемом орбитальном шейкере при 37 ºС.Real-time мониторинг и регистрацию параметров проводили непосредственно в колбах. Все параметры непрерывно и синхронно обрабатывались в режиме реального времени с помощью аппаратно-программного комплекса, включающего несколько блоков регистрации. Парциальное давление кислорода (dO2) измеряли электродом Кларка InPro 6800 (Mettler Toledo) на модифицированном контроллере BioFlo 110 (New Brunswick Scientifi c Co., USA). Концентрацию экстраклеточного сульфид-иона определяли с помощью сульфид-специфичного ионоселективного халькогенидного электрода (pS2-)XC-S2--001 (Sensor Systems Company, РФ), изменение редокс-потенциала (Eh) регистрировали платиновым электродом ЭРП-105 («Измерительные Технологии», РФ), уровни экстраклеточных ионов калия (K+) регистрировали K+-селективным электродом ELIS-121K («Измерительные Технологии», РФ). Потенциометрические данные с этих электродов обрабатывались цифровыми pX-метрами cpX-2 (ИБП, Пущино, РФ),работающими в синхронизированном режиме. Оптическую плотность и удельную скорость роста определяли традиционным способом.Добавление 2 mM H2O2 в бесклеточную среду не оказывало значительного влияния на потенциал электрода Кларка и K+-специфичного сенсора, но несколько повышало базовые значения сульфид-специфичного и платинового электродов.Сразу после внесения пероксида водорода в растущую культуру, наблюдалось обратимое ингибирование скорости роста, длившееся в течение 30 мин. Одновременно с остановкой роста отмечалось кратковременное резкое увеличение dO2, что связано с деструкцией добавленного пероксида эндогенными пероксидазами с образованием молекулярного кислорода.Синхронно с изменениями скорости роста наблюдался кратковременный выход ионов K+ из клеток с последующим медленным его поглощением, продолжавшимся в течение 30 мин, что по времени совпадало с периодом возобновления роста. Индукция окислительного стресса пероксидом вызывала резкое падение потенциала сульфид-специфичного сенсора, что указывает на усиление продукции эндогенного сульфида клетками E. coli, которое продолжалось в течение 25 мин. Как было показано ранее, это может быть следствием десульфидации избытка цистеина при ингибировании синтеза белка вследствие остановки роста (Smirnova et al., 2019, DOI: 10.1007/s00726-019-02795-2). В этих условиях Eh среды, резко падал в область отрицательных значений (относительно нового базового уровня). Профиль изменения Eh коррелировал с показаниями сульфид-специфичного электрода.Применение комплексного подхода с применением электрохимических сенсоров, работающих в режиме real-time, позволило выявить тесную связь между изменениями такими параметрами как удельная скорость роста, продукция эндогенного сульфида и редокс-потенциала культуры при ответе растущих бактерий E. coli на пероксидный стресс. |
