| Popis: |
Ферменты, известные как «холестериноксидазы» (ХО, EC 1.1.3.6) и превращающие холестерин (5-холестен-3β-ол) в 4-холестен-3-он, не только играют значимую роль в метаболизме продуцирующих их бактерий, но также имеют важнейшее практическое значение, находя применение в медицине, фармакологии, сельском хозяйстве, химии и биотехнологии. ХО представляет собой ФАД-содержащий белок, проявляющий двойственную активность: оксидоредуктазную и изомеразную; при этом сначала происходит окисление 3β-гидрокси-группы до 3-кето-группы, а затем изомеризация двойной связи Δ5(6) в Δ4(5) в системе колец стероидного ядра. Образовавшийся при этом восстановленный ФАД реагирует с молекулой кислорода с образованием перекиси водорода (рис. 1). Холестериноксидазы известны с середины XX века, однако лишь относительно недавно были обнаружены и изучены высокоактивные растворимые формы ХО, перспективные для прикладного применения и продуцируемые, преимущественно, актиномицетами. Поиск новых высокоактивных и стабильных ХО необходим для успешного развития таких важнейших сфер, как экспресс-анализ холестерина в биологических жидкостях, создание безопасных инсектицидов, а также терапия злокачественных опухолей. Ранее было выявлено наличие у актинобактерии Nocardioides simplex ВКМ Ac-2033Д способности к эффективной трансформации холестерина в холестенон. В геноме N. simplex выявлен ген ХО, в то время как других генов, продукты которых могут быть ответственны за осуществление модификации 3-гидрокси-5-ен- в 3-кето-4-ен-группировку, например, 3-гидроксистероиддегидрогеназы, в геноме N. simplex не выявлено. В рамках данной работы нами была впервые получена и охарактеризована рекомбинантная зрелая форма ХО N. simplex. Зрелая форма ХО N. simplex (55,6 кДа) с 6xHis-меткой была получена путём экспрессии в клетках Escherichia coli соответствующей нуклеотидной последовательности (рис. 2). Выделение и очистку рекомбинантной ХО N. simplex (ХОNs) проводили с помощью аффинной хроматографии. Фермент проявлял активность по отношению к холестерину, холестанолу, фитостерину, прегненолону и дегидроэпиандростерону. Активность ХО зависела от структуры и длины алифатической боковой цепи при С17 стероида и была ниже для прегненолона и дегидроэпиандростерона (табл. 2). ХОNs проявляла активность в диапазоне рН 5,25–6,5 с оптимумом рН 6,0. Анализ кинетических характеристик и тестов на стабильность при хранении показал, что показатели ХОNs сравнимы или превосходят таковые для коммерческой ХО из Streptomyces hygroscopicus (ХОSh). При определении активности ХОNs методами спектрофотометрии, ВЭЖХ и ТСХ было обнаружено, что выбор подходящей реакционной среды крайне важен для получения адекватных результатов. Реакционная среда, основанная на солюбилизации стероидов в присутствии холата натрия и Triton X-100, позволила фиксировать конверсию холестерина в холест-4-ен-3-он методом ТСХ, но препятствовала реакции окисления 2,2-азино-диэтилбензтиазолинсульфоната (АБТС) в сопряженной реакции с пероксидазой хрена. Напротив, использование среды с метилированным циклодекстрином обеспечило применение экспресс-метода спектрофотометрического измерения активности ХОNs, однако конверсия стероидов в таких реакционных смесях оказалась существенно ниже ожидаемой при использовании методов ТСХ и ВЭЖХ. Корректность применяемых подходов была подтверждена экспериментами с коммерческой ХОSh с получением характеристик, близких к заявленным производителем. Кинетические характеристики ХОNs в отношении холестерина – Vmax и kcat – оказались близки к таковым для ХОSh. Однако значение KM для ХОNs было выше в 2 раза по сравнению с KM для ХОSh и, соответственно, каталитическая эффективность (kcat/KM) у ХОNs была вдвое ниже. Спектрофотометрические измерения активности двух ферментов при высоких концентрациях холестерина (≥1 мМ) позволили выявить эффект, схожий с субстратным ингибированием. Значения величины KM, составившие 6.1⋅10−4±0.05⋅10−4 М для ХОNs и 3.1⋅10−4±0.014⋅10−4 M для коммерческой ХОSh, полученные нами при использовании циклодекстриновой среды, сравнимы с данными для ХО Streptomyces sp. (KM 2.17⋅10−4 M) в среде с холатом натрия и Triton X-100. Результаты расширяют знания о микробных ХО и свидетельствуют о том, что ХО из N. simplex ВКМ Ас-2033Д перспективна для дальнейшего практического применения. |
