Voltage sensitive phosphatases: understanding their function and expanding their potential use

Autor: Mavrantoni, Angeliki
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2016
Předmět:
DOI: 10.17192/z2016.0333
Popis: Voltage sensitive phosphatases (VSPs) are proteins consisting of two distinct domains: a transmembrane voltage sensor domain (VSD) and a cytosolic phosphatase domain highly similar to the human tumor suppressor protein PTEN (phosphatase and tensin homologue deleted from chromosome 10). The first characterized VSP was isolated from the sea squirt Ciona Intestinalis, named Ci-VSP, one decade ago. Upon membrane depolarization, Ci-VSP has phosphatase activity against phosphoinositide (PI) substrates and acts predominantly as a 5-phosphatase of PI(4,5)P2 and PI(3,4,5)P3. VSPs exist in several species, including human, and although their function and physiological role are not completely understood, they have been proven excellent tools to rapidly and reversibly alter the phosphoinositide content of the plasma membrane in living cells. The first part of this work focuses on further characterizing and understanding the function of VSPs by using well established techniques. We used whole-cell patch clamping to control VSPs and total internal reflection fluorescent (TIRF) microscopy to record their activity. We first investigated the human VSP isoform 1 (hVSP1). hVSP1 lacks plasma membrane localization and has not been characterized in depth. Here we attempted to target hVSP1 to the plasma membrane and examine its enzymatic activity. We found that complete replacement of the VSD of hVSP1 with that of Ci-VSP resulted in a membrane targeted, voltage activated 5-phosphatase of PI(4,5)P2. Given the similarity of VSPs with PTEN, the chimeric protein PTENCiV had been created previously by fusing the VSD of Ci-VSP with PTEN. PTENCiV fully represents the enzymatic activity of PTEN (3-phosphatase of PI(3,4)P2 and PI(3,4,5)P3) and by being voltage regulated it comprises a powerful tool for studying this tumor suppressor. Specifically, we characterized the enzymatic activity of a novel PTEN mutation, A126G, identified from a prostate cancer patient. This mutation was found to convert the substrate specificity of PTEN from a 3- to a 5-phosphatase. VSPs are suggested to be involved in processes where pH and redox state changes are known to occur. Therefore we next investigated the effect of intracellular pH and redox state on VSPs activity. We saw that acidic pH increases the PI(4,5)P2 depletion by VSPs, while oxidation inhibits the enzymatic activity. Thus, it seems possible that pH and oxidation can, in addition to voltage, contribute to a fine modulation of VSPs. In the second part, we developed an easily applicable method to use VSPs for manipulation of PI levels without the use of patch clamping. We used different cation channels that upon activation led to membrane depolarization and consequently VSP activation. We then characterized methods to monitor PIs levels, using fluorescence microscopy or photometry. At last, we demonstrated the application of these techniques by employing PTENCiV to characterize the effect of known PTEN mutations and analyze the effect of PTEN inhibitors. In conclusion, in this work we increased our understanding regarding several aspects of VSPs activity, including hVSP1 and PTEN substrate specificity as well as the regulation of VSPs by intracellular pH and redox state. Lastly, we established an approach that allows for rapid manipulation and monitoring of PI levels in a population of cells and facilitates the study of PTEN mutations and pharmacological targeting.
Spannungsempfindliche Phosphatasen (englisch: Voltage Sensitive Phosphatases, VSPs) sind Proteine, die aus zwei unterschiedlichen Teilen bestehen: einer transmembranen Spannungssensor-Domäne (VSD) und einer zytosolischen Phosphatase-Domäne. Die Spannungssensor-Domäne steuert die katalytische Aktivität einer Phosphatase, sehr ähnlich wie bei dem menschlichen Tumorsuppressorprotein PTEN (Phosphatase- und Tensin-Homolog gelöscht von Chromosom 10). Die erste charakterisierte VSP, Ci-VSP, wurde vor einem Jahrzehnt, von der Seescheide Ciona Intestinalis isoliert. Ci-VSP hat bei Membrandepolarisation eine Phosphatase-Aktivität gegenüber Phosphoinositid (PI) Substraten und sie wirkt vor allem als 5-Phosphatase von PI(4,5)P2 und PI(3,4,5)P3. VSPs wurden in verschiedenen Spezies gefunden, einschließlich dem Menschen. Trotz des fehlenden vollständigen Verständnisses, sind VSPs ausgezeichnete Werkzeuge, um den Phosphoinositid-Gehalt der Plasmamembran in lebenden Zellen schnell und reversibel zu ändern. Der erste Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die weitere Charakterisierung und das Verständnis der Funktion der VSPs mit Hilfe gut etablierter Techniken. Wir verwendeten die Whole-Cell-Patch-Clamp-Technik, um die VSPs zu kontrollieren und Interne Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (englisch: Total Internal Reflection Fluorescence microscopy, TIRF) um ihre Aktivität aufzunehmen. Zuerst untersuchten wir die menschliche VSP-Isoform 1 (hVSP1). hVSP1 zeigt keine Plasmamembran-Lokalisation und deshalb ist es nicht tiefergehend charakterisiert worden. Hier haben wir versucht, hVSP1 an die Plasmamembran zu bringen und ihre enzymatische Aktivität zu untersuchen. Wir stellten fest, dass eine vollständige Ersetzung der Spannungssensor-Domäne von hVSP1 durch die von Ci-VSP eine membranständige, spannungsaktivierte 5-Phosphatase von PI(4,5)P2 ergibt. Angesichts der Ähnlichkeit der VSPs mit PTEN wurde durch Verbindung der VSD von Ci-VSP mit PTEN das chimärische Protein PTENCiV erstellt. PTENCiV, behält die vollständige enzymatische Aktivität von PTEN (PTEN wirkt als 3-Phosphatase von PI(3,4)P2 und PI(3,4,5)P3). Die zusätzliche Regulierbarkeit durch Spannung macht PTENCiV zu einem leistungsfähigen Werkzeug für die Untersuchung dieses Tumorsuppressors. Insbesondere haben wir die enzymatische Aktivität der neuen Prostatakrebs-PTEN-Mutation A126G charakterisiert. Wir fanden heraus, dass die A126G-Mutante die Substratspezifität von PTEN von einer 3-zu einer 5-Phosphatase konvertiert. Es wird vermutet, dass VSPs in Prozessen, in denen pH- und Redox-Zustandsänderungen auftreten, beteiligt sind. Deshalb untersuchten wir als Nächstes die Wirkung von intrazellulärem pH-Wert und von Redox-Zustand auf VSPs. Wir sahen, dass ein saurer pH-Wert den PI(4,5)P2 Abbau in allen getesteten VSPs erhöht, und dass Oxidation die enzymatische Aktivität von Ci-VSP hemmt. Es scheint daher möglich, dass zusätzlich zur Spannung auch pH-Wert und Oxidation zu einer feinen Modulation von VSPs beitragen. Im zweiten Teil entwickelten wir eine leichtanwendbare Methode zur Manipulation von PI-Pegeln -unter Verwendung von VSPs aber ohne die Notwendigkeit der Patch-Clamp-Technik. Wir setzten verschiedene Kationenkanälen ein, die bei Aktivierung zu Membrandepolarisation führten und sequenziell zur VSP-Aktivierung. Als Nächstes charakterisierten wir Methoden um PI(4,5)P2 und PI(3,4,5)P3 unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie oder Photometrie zu kontrollieren. Außerdem haben wir die Anwendbarkeit dieser Techniken gezeigt, um die Wirkung von bekannten PTEN-Mutationen und PTEN-Inhibitoren durch Verwendung der PTENCiV Chimäre zu untersuchen. Als Ergebnis dieser Arbeit erhöhen wir das Verständnis über verschiedene Aspekte der VSP-Aktivität, einschließlich der Substrat Spezifität von hVSP1 und PTEN, sowie der Regulierung der VSP durch intrazellulären pH-Wert und Redox-Zustand. Außerdem haben wir einen Ansatz etabliert, der nicht nur zügige Manipulation und Kontrolle des PI-Gehalts in einer Population von Zellen zulässt, sondern der auch die Untersuchung von PTEN-Mutanten und Pharmakologie erleichtert.
Databáze: OpenAIRE
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