| Popis: |
Интенсивный солнечный свет вызывает повреждения фотосинтетического аппарата. Для защиты хлорофилл-белковых комплексов от светового стресса большое значение имеют светоиндуцируемые стрессовые белки, к которым относятся Hlips (high-light-inducible proteins) цианобактерий. Эти мембранные белки считаются предшественниками светособирающего комплекса высших растений и водорослей [1]. Hlips принимают участие в нефотохимическом тушении избыточно поглощённой световой энергии, сборке и репарации фотосистемы II, транспорте и связывании хлорофилла. Важная функция этих белков – связывание свободного хлорофилла и предотвращение образования активных форм кислорода [2]. В последнее время исследователи получили новые данные об особенностях Hlips [3], однако многое остаётся невыясненным. Ранее предполагали, что HliA и HliB образуют димеры и выполняют аналогичные функции. В недавних исследованиях [3] было установлено, что указанные белки не образуют димеров, а взаимодействуют с другими Hlips. Для выяснения структурных особенностей двух белков – HliA и HliB нами были использованы спектральные и биоинформатические методы. С помощью спектральных и биоинформатических методов нами было установлено, что HliA и HliB цианобактерии Synechocystis sp. не являются взаимозаменяемыми, так как имеют некоторые структурные, а, следовательно, и функциональные различия. Эти белки имеют небольшие размеры – 70 аминокислотных остатков. Выравнивание аминокислотных последовательностей HliA и HliB показало, что их идентичность составляет 87,14%. Оба белка содержат достаточно протяжённый трансмембранный участок – у HliA 23 аминокислотных остатка, у HliB – 24. Предсказанные модели HliA и HliB сходны (рис. 1 а, б). С помощью сервера I-TASSER (https://zhanggroup.org/I-TASSER/) на основании аминокислотной последовательности HliA и HliB были спрогнозированы структурные модели белков и функций, выполняемых ими в клетке [4]. Оба белка были определены как мембранные и малорастворимые. В качестве наиболее вероятного лиганда для HliA и HliB был выбран хлорофилл а. Были выделены чистые рекомбинантные белки HliA и HliB. Для выделения и очистки HliA и HliB, на основе вектора pET-28a были сконструированы плазмиды, несущие синтетический ген белка (ЗАО Евроген). Опыты велись последовательно, сначала c белком HliA, позже – с HliB. Рекомбинантный белок выделяли из клеток E. coli с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA смоле (Thermo-Fisher, США). При снятии очищенного белка с колонки буфером для элюции (15 мМ NaH2PO4⋅2H2O, 0,07 М KF, 0,015 М мочевина, 0,1 мМ PMSF, pH 4,5), HliB показал значительно большую гидрофобность по сравнению с HliA. Чтобы избежать образования белковых агрегатов, содержание мочевины в буфере для элюции было повышено до 8 М. Для выяснения структурных особенностей молекул белков HliA и HliB были измерены спектры флуоресценции. Она определяется флуоресценцией остатков триптофана (длина волны возбуждения 297 нм) и, в меньшей степени, остатков тирозина и фенилаланина (длина волны возбуждения 280 нм). В зависимости от их локализации в белковой глобуле и молекулярного окружения, спектр флуоресценции может иметь разную форму и положение максимума [5]. Спектры флуоресценции белков HliA и HliB проводили на спектрофлуорофотометре RF-5301 PC (Shimadzu, Япония) при 20 °C. Возбуждали при 295 нм (ширина полосы пропускания щели 2 нм) и регистрировали в диапазоне 300–700 нм (ширина полосы пропускания щели 5 нм) со скоростью 200 нм/мин. Данные, полученные при измерении флуоресценции белков, имели определённое сходство, однако значения максимумов не совпадали. Пик флуоресценции в диапазоне 610–700 нм для HliA наблюдается при 658 нм, для HliB – при 655 нм. Такие различия можно объяснить структурными особенностями HliA и HliB и аминокислотным составом белков. По-видимому, белки, несмотря на структурное сходство, не являются взаимозаменяемыми. |
