| Popis: |
Принципиальным моментом в наших исследованиях было обнаружение каналов в клеточной стенке у дрожжей Candida maltosa ВКМ Y-2359 в условиях голодания. Было отмечено, что в процессе голодания соотношение «живых и мертвых» клеток при окраске Dead/Life Yeast Cell стабильно неизменно. Возможно, что каналы и их экзоцеллюлярные компоненты с иммобилизованными ферментами участвуют в деструкции продуктов лизиса «мертвых» клеток для поддержания жизнеспособности «живых» клеток. Было сделано предположение, что мы наблюдаем программируемую клеточную гибель, т.е. апоптоз. Дрожжевые клетки могут гибнуть как при воздействии крайне жёстких условий микроокружения через случайную гибель клеток (ACD – Accidental cell death), так и при ответе на умеренный стресс через регулируемую гибель клеток (RCD – Regulated cell death). Тогда как ACD всегда идёт через некротический морфотип (уничтожение структур клетки, разрывы в плазматической мембране), RCD может проявлять целый спектр морфологий и быть результатом разных сигнальных путей, включая регулируемый некроз или апоптоз. Программируемая гибель клеток (PCD) происходит строго в физиологических сценариях, (например, в ходе развития), и предположительный ответ по аннексину V, выход фосфатидилсерина на наружный слой плазмалеммы представляет собой специфический тип RCD. Возможная роль аутофагии как пути гибели клеток остаётся неясной, тогда как её цитопротективные свойства хорошо известны. Для проверки этого предположения были проведены некоторые рекомендуемые тесты. Фиксация с применением KMnO4 позволила выявлять целостность мембран ядра и митохондрий у голодающей популяции и одновременно выявить патологические нарушение в структуре этих органелл. Это свидетельствует в пользу регулируемой клеточной гибели, исключая ACD некрозы (рис. 1). Электронная микроскопия методом сверхбыстрой криофиксации и последующим замещением воды ацетоном с фиксатором OsO4 позволило увидеть начальный процесс конденсации хроматина в ядре, которое говорит о начале апоптических процессов в клетке (рис. 1б) Также конденсация хроматина была обнаружена с помощью флуоресцентной микроскопии (окраски ядер DAPI) в некоторых клетках популяции (рис. 1в). Как видно из рис. 2 падение оптической оптической плотности прекращается на 20 часах и далее медленно уменьшается к 200 часу. Процент Pi+ (мертвых) клеток становится стабильным к 90 часам и плавает в пределе 30% от общего числа клеток в популяции. Это говорит о том, что, скорее всего мы наблюдаем RCD, т.к. при медленном падении общего числа клеток соотношения живых к мертвым остается стабильно неизменным. Тогда как при некрозе увеличивалось бы количество мертвых клеток в популяции при таком же медленном падении общего числа клеток в популяции. Также начальное повышение оптической плотности, отображенное на графике, при переносе культуры в условия голодания по углероду совпадает с началом формирования каналов у голодающей культуры, а также изменением уровня основных полисахаридных компонентов клеточной стенки и активизации гидролаз (Dmitriev, 2016), что говорит об участии этих структур в происходящих процессах в начале голодания. |
