Efecto de la mutación Asp187Gly de Cdh1 sobre la actividad de la E3 ubiquitina ligasa APC/C

Autor: Sancha Ortega, Leticia
Přispěvatelé: Almeida, Angeles
Rok vydání: 2020
Zdroj: Digital.CSIC. Repositorio Institucional del CSIC
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Popis: [ES] El gen Fzr1 (Fizzy-related protein o proteína 1 relacionada con Fizzy) codifica la proteína Cdh1, que es un cofactor de la E3 ubiquitina ligasa Complejo Promotor de la Anafase/Ciclosoma (APC/C). APC/C-Cdh1 regula funciones de regulación de la mitosis [Watson et al., 2019] y no mitóticas [Almeida, 2012]. Además de la regulación del ciclo celular, APC/C-Cdh1 juega un papel clave en la supervivencia neuronal [Maestre et al., 2008] y la neurogénesis durante el desarrollo [Delgado-Esteban et al., 2013]. Recientemente, nuestro grupo ha identificado la mutación humana (p.Asp187Gly) del gen Fzr1 (c.560A > G) como una nueva causa de microcefalia prenatal, ya que provoca la pérdida de función de APC/C-Cdh1 [Rodríguez et al., 2019]. Sin embargo, los mecanismos responsables de dicha pérdida son desconocidos. El objetivo del presente trabajo ha sido investigar los mecanismos moleculares responsables de la pérdida de actividad del complejo APC/C causada por la mutación Asp187Gly de Cdh1, centrándonos en el estudio de la estabilidad de Cdh1 y la interacción con sus sustratos. Con este fin, se empleó la línea celular procedente de riñón embrionario humano 293T (HEK293T) transfectada con un vector que expresa la proteína mutada. Nuestros resultados mostraron que la expresión de la forma mutada de Cdh1 en las células HEK293T confirmaba la pérdida de actividad de APC/C, así como la inestabilidad de la proteína, respecto a las células que expresaban la condición wild-type. Además, nuestros resultados sugieren una mayor degradación de Cdh1 vía proteosoma, ya que la variante mutada se localizaba fundamentalmente en el núcleo, donde es susceptible de ser marcada para su degradación por las ligasas APC/C y Skp1 Cullin1 F-box (SCF). Sin embargo, la variante wild-type se localizaba tanto en el núcleo como en el citosol, donde su estabilidad es mayor. Finalmente, hemos observado cómo la mutación Asp187Gly de Cdh1, localizada en la primera repetición del dominio WD40 de la proteína y esencial para las interacciones proteína-proteína, afecta al reconocimiento y unión a sus sustratos. En conclusión, nuestros resultados demuestran que la mutación Asp187Gly altera la estabilidad y la capacidad de reconocimiento de sustratos de la proteína Cdh1, afectando así a la actividad del complejo APC/C. Estos resultados proporcionan nuevas herramientas para descifrar la regulación de la actividad del complejo APC/C-Cdh1 y su participación en importantes procesos como el control del tamaño de la corteza cerebral.
[EN] The Fizzy-related protein 1 (Fzr1) gene encodes the Cdh1 protein, a coactivator of the E3 ubiquitin ligase Anaphase Promoting Complex/Cyclosome (APC/C). APC/C-Cdh1 regulates mitotic [Watson et al., 2019] and non-mitotic functions [Almeida, 2012]. In addition to cell cycle regulation, APC/C-Cdh1 plays a key role in neuronal survival [Maestre et al., 2008] and neurogenesis during brain development [Delgado-Esteban et al., 2013]. Recently, we described that the loss of function of APC/C-Cdh1 caused by a novel human mutation (p.Asp187Gly) in the Fzr1 gene (c.560A > G) results in a new cause of prenatal microcephaly [Rodríguez et al., 2019]. The aim of the present project was to understand the molecular mechanisms involved in APC/C loss of activity due to the Cdh1 Asp187Gly mutation, focusing on the study of Cdh1 stability and the interaction with its targets. To this end, we used the human embryonic kidney 293T (HEK293T) cell line transfected with a cDNA-containing vector of the mutated gene. Our results showed that the expression of Asp187Gly mutant form of Cdh1 in HEK293T cells confirmed the inactivation of APC/C and the decreased in Cdh1 protein levels, in comparison with Cdh1 wild type-expressing cells. Moreover, our results suggest an increased proteosomal degradation of the mutant variant, due to an accumulations of the Asp187Gly mutant in the nucleus, where it is targeted for degradation by APC/C and Skp1 Cullin1 F-box (SCF). However, wild-type Cdh1 was located in both the nucleus and the cytosol, whereas it is stabilized. Finally, we have observed that Cdh1 Asp187Gly mutation, located in the essential protein-protein interaction WD40 domain, affects Cdh1 ability to recognize and bind to its substrates. In conclusion, we found that the Cdh1 Asp187Gly mutation impairs Cdh1 protein stability and substrate recognition, thus affecting APC/C activity. These results provide new tools to understand the regulation of APC/C-Cdh1 complex activity and its involvement in important processes such as the control of cerebral cortex size.
Databáze: OpenAIRE
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