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A resistência à quimioterapia é um problema grave no tratamento de doenças infeciosas e parasitárias e oncológicas. Microrganismos procariotas (bactérias), agentes patogénicos eucariotas (fungos, helmintas e protozoários) e células eucariotas, como é o caso das células tumorais, desenvolvem frequentemente resistência aos agentes quimioterápicos. A resistência a múltiplos fármacos (MDR) está relacionada com o aumento da expressão e atividade do sistema membranar de transportadores de efluxo (bombas ABC). Estas bombas são responsáveis por falhas terapêuticas tanto no cancro como nas doenças infeciosas. Embora existam diversos moduladores de bombas ABC, estes transportadores são ubiquamente expressos nos tecidos epiteliais humanos, pelo que a aplicação clinica de inibidores de bombas de efluxo causa grave toxicidade sistémica. Permanece, portanto, a necessidade de encontrar moduladores menos tóxicos capazes de reverter o fenótipo MDR, resensibilizando as células resistentes à quimioterapia. O reconhecimento da existência de fitoquímicos capazes de modular os transportadores ABC com menor toxicidade tem gerado novas linhas de investigação. Este estudo teve como objetivo principal avaliar a influência de bombas de efluxo ABCB1 no desenvolvimento de quimioresistência e analisar a atividade pleiotrópica de moduladores sintéticos e naturais de bombas de efluxo em diversos modelos biológicos: parasita multicelular (Schistosoma mansoni), linha macrofágica de murganho infetada por um protozoário intracelular (Leishmania infantum) e linhas celulares malignas de origem humana. Os métodos regularmente utilizados no estudo dos transportadores ABC não permitem determinar a sua eficácia em tempo real. Neste estudo foram aplicadas metodologias baseadas no transporte celular de substratos fluorescentes capazes de avaliar em tempo real a funcionalidade das bombas de efluxo por fluorimetria e por citometria de fluxo. A microscopia de fluorescência e a técnica de PCR quantitativo em tempo real (RT-qPCR) foram também aplicadas. Nos ensaios ex vivo foi possível demonstrar que as bombas ABCB1 de S. mansoni estavam envolvidas na resistência ao prazinquantel e que verapamil (VP), modulador sintético de bombas ABCB1, reverte a resistência. Nos macrófagos modificados pela infeção por L. infantum foi observado um expressivo incremento de bombas ABCB1 na membrana celular. Inibidores sintéticos de canais iónicos e de bombas de efluxo, como VP, ouabaína, tioridazina e cloropromazina, e o composto natural 6-gingerol (6G) reduziram a atividade de efluxo dos macrófagos não infetados. Complementarmente a atividade destes moduladores foi também relacionada com o stress oxidativo dos macrófagos. O tratamento com inibidores sintéticos de efluxo e com o 6G diminuiu a sobrevivência dos parasitas intracelulares e a sua capacidade de se multiplicar, sugerindo que estes moduladores e o VP, em particular, podem ter um efeito leishmanicida direto ou indireto. Em células de carcinoma mamário resistentes à doxorrubicina e com sobreexpressão de bombas ABCB1, o VP reverteu a resistência ao paclitaxel e o 6G mostrou ser citotóxico para as células resistentes, o que poderá estar relacionado com oincremento das espécies reativas de oxigénio, e consequentemente com o desequilíbrio homeostático. Nestas células foi possível demonstrar correlação direta entre a atividade de efluxo e a expressão das bombas ABCB1 e que os microRNAs podem modular o fenótipo resistente, interferindo na expressão génica de transportadores ABCB1. Resistance to chemotherapy is a serious problem in the treatment of infectious and parasitic and oncological diseases. Prokaryotic microorganisms (bacteria), eukaryotic pathogens (fungi, helminths and protozoa) and eukaryotic cells, such as tumor cells, often develop resistance to chemotherapeutic agents. Multiple drug resistance (MDR) is related to an increased expression and activity of the membrane efflux transporter systems (ABC pumps). These pumps are responsible for therapeutic failures in both cancer and infectious diseases. Although there are several ABC pump modulators, these transporters are ubiquitously expressed in human epithelial tissues, so the clinical application of efflux pump inhibitors causes severe systemic toxicity. Therefore, there is a need to find less toxic modulators capable of reversing the MDR phenotype and resensitize resistant cells to chemotherapy. The recognition of the existence of phytochemicals capable of modulating ABC transporters with lower toxicity has generated new lines of investigation. The objective of this study was to evaluate the influence of ABCB1 efflux pumps on the development of chemoresistance and to analyze the pleiotropic activity of synthetic and natural modulators of efflux pumps in several biological models: multicellular parasite (Schistosoma mansoni), murine macrophage cell lines infected by an intracellular protozoan (Leishmania infantum) and malignant cell lines of human origin. The methods regularly used in the study of ABC transporters are not able to determine their effectiveness in real-time. In this study, methodologies based on the cellular transport of fluorescent substrates capable of evaluating in real time the functionality of the efflux pumps by fluorometry and by flow cytometry were used. Fluorescence microscopy and the quantitative real-time PCR technique (RT-qPCR) were also applied. In the ex vivo assays it was possible to demonstrate that S. mansoni ABCB1 pumps were involved in praziquantel resistance and that verapamil (VP), synthetic pump modulator ABCB1, reverses the resistance. In macrophages modified by infection by L. infantum an expressive increase of ABCB1 pumps in the cell membrane was observed. Synthetic ion channel inhibitors and efflux pumps, such as VP, ouabain, thioridazine and chlorpromazine, and natural compound 6-gingerol (6G) reduced the efflux activity of uninfected macrophages. In addition, the activity of these modulators was also related to the oxidative stress of the macrophages. Treatment with synthetic inhibitors of efflux and with 6G decreased the survival of intracellular parasites and their ability to multiply, suggesting that these modulators and VP in particular may have a direct or indirect leishmanicidal effect. In breast carcinoma cells resistant to doxorubicin and with overexpression of ABCB1 pumps, VP reversed resistance to paclitaxel and 6G was cytotoxic to resistant cells, which may be related to the increase of reactive oxygen species, and consequently to the homeostatic imbalance. In these cells it was possible to demonstrate a direct correlation between efflux activity and ABCB1 pump expression and that microRNAs can modulate the resistant phenotype by interfering with the gene expression of ABCB1 transporters. |
