Development of sub-hour on-line comprehensive 2D-LC methods for the analysis of complex samples

Autor: Chapel, Soraya
Přispěvatelé: Institut des Sciences Analytiques (ISA), Institut de Chimie du CNRS (INC)-Université Claude Bernard Lyon 1 (UCBL), Université de Lyon-Université de Lyon-Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Université de Lyon, Sabine Heinisch, STAR, ABES
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2021
Předmět:
Zdroj: Analytical chemistry. Université de Lyon, 2021. English. ⟨NNT : 2021LYSE1106⟩
Popis: In response to the increasing demand for ever more efficient and high-throughput separations from most fields of application, a lot of effort is being put into the development of multi-dimensional separation techniques. As a result of its potential to generate high peak capacities in acceptable analysis times, in recent years, on-line comprehensive two-dimensional liquid chromatography (LC x LC) has emerged as a powerful tool for the analysis of highly complex mixtures. Despite its attractiveness, additional complexity and difficulties compared to conventional one-dimensional liquid chromatography (1D-LC) still hamper the proliferation of this technique. One of the most prominent challenges lies in the fact that attempts to maximize the coverage of the 2D separation space often results in counterproductive effects deteriorating the overall performance of the method. Therefore, in this thesis, a particular focus has been put on addressing this issue. In the present contribution, the value of on-line LC x LC for sub-hour separation of complex protein and peptide samples is demonstrated. First, the advantages of on-line reversed-phase LC x reversed-phase LC (RPLC x RPLC) compared to 1D-reversed-phase LC (1D-RPLC) are highlighted for the separation of a protein tryptic digest, both in terms of peak capacity and detection sensitivity. In a second part, two different approaches to improve the retention space coverage are explored for peptide analysis. The first one involves the use of variable gradients in the second dimension, whereas the second one relies on the use of different and complementary combinations in both dimensions, namely, hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) and RPLC. It is shown that both approaches are effective for this purpose but also bring about specific constraints, which are discussed in detail here. In on-line HILIC x RPLC, the reversed elution strength of the mobile phases used in both dimensions often causes severe peak shape deformations, which impair the separation performance in the second dimension. A possible strategy to circumvent these deleterious effects is presented. This strategy is then compared to some of the most frequently used approaches in the literature. Their respective strengths and weaknesses are discussed in the specific context of peptide analysis. Finally, in the last part, the applicability of on-line LC x LC methods hyphenated with ultraviolet and high-resolution mass spectrometry detections, to the characterization of antibody-drug conjugates, is demonstrated, using cation-exchange chromatography in the first- and RPLC in the second dimension.
Grâce à son très haut pouvoir séparatif, la chromatographie liquide bidimensionnelle compréhensive en ligne (LC x LC) s'est imposée comme un outil puissant pour l'analyse d’échantillons complexes ces dernières années. Cependant, du fait de sa complexité par rapport à la chromatographie liquide unidimensionnelle classique (1D-LC), la prolifération de cette technique demeure relativement limitée. L'une des difficultés majeures de cette technique consiste à parvenir à maximiser l’occupation de l'espace de séparation bidimensionnel, tout en minimisant les effets néfastes qui bien souvent en découlent, sur les performances globales de la méthode. Dans cette thèse, une attention particulière a été portée à cette problématique. Ce manuscrit montre le potentiel de la LC x LC en ligne pour la séparation d'échantillons complexes de protéines et de peptides en moins d'une heure. Tout d’abord, les avantages de la LC x LC combinant la chromatographie en phase inverse (RPLC) dans les deux dimensions, par rapport à la chromatographie liquide unidimensionnelle en phase inverse classique (1D-RPLC), sont mis en évidence, pour la séparation de digestions de protéines. Dans une deuxième partie, deux approches possibles pour améliorer l’occupation de l’espace de séparation bidimensionnel pour l’analyse de peptides sont explorées. La première approche implique l’utilisation de programmes de gradients variables dans la deuxième dimension, tandis que la deuxième approche repose sur le couplage de deux méthodes différentes et complémentaires, à savoir, la chromatographie liquide à interaction hydrophile (HILIC) et la RPLC. Bien que ces deux approches soient efficaces à cet effet, chacune d’entre elles apporte son lot de difficultés, qui sont discutées en détail ici. Dans le cas de la HILIC x RPLC en ligne, la différence de force éluante entre les phases mobiles des deux dimensions, donne généralement lieu à des déformations de pics, qui dégradent la qualité de séparation dans la deuxième dimension. Une stratégie possible pour éviter ces effets est présentée ici. Cette stratégie est ensuite comparée à trois des approches les plus utilisées dans la littérature. Les avantages et inconvénients de chacune des stratégies explorées sont mis en exergues, dans le contexte spécifique de l’analyse de peptides. Pour finir, dans une dernière partie, l’intérêt de la LC x LC couplée à la détection ultraviolet et à la détection par spectrométrie de masse à haute résolution, pour la caractérisation de conjugués d’anticorps-médicaments, est souligné, en utilisant la chromatographie à échange de cations en première dimension et la RPLC en deuxième dimension.
Databáze: OpenAIRE
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