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A transmissão de Plasmodium ao mosquito e o seu desenvolvimento esporogónico são alvos importantes para o desenvolvimento de métodos de controlo de transmissão. Nesta fase do ciclo de vida, o parasita enfrenta condições muito adversas derivadas do mosquito e da própria refeição sanguínea. É nesta altura que se observam as maiores reduções do número de parasitas e como tal a manipulação artificial destas condições poderia levar a uma redução significativa da transmissão. Vários factores da refeição sanguínea tais como anticorpos, fármacos, refeições múltiplas ou presença de várias estirpes ou espécies de parasitas, podem diminuir ou pelo contrário potenciar a transmissão. Além disso, o ambiente no intestino médio é adverso devido à digestão da refeição sanguínea e a uma resposta imunológica eficaz produzida pelo mosquito contra o parasita. Várias linhas experimentais foram seguidas no sentido de contribuir para o entendimento da forma como alguns destes factores afectam o desenvolvimento do parasita. Estudou-se o efeito de uma segunda alimentação sanguínea e de soro de Rattus rattus e de Mus musculus (BALB/c) contendo anticorpos anti-esporozoíto de Plasmodium yoelii yoelii, na taxa e na intensidade de infecção em mosquitos Anopheles stephensi. Foram ainda avaliadas alterações na expressão de genes do parasita e do mosquito, pelo método de DDRT-PCR e os resultados confirmados por qRT-PCR. A taxa e a intensidade de infecção foram reduzidas de forma significativa quando os mosquitos foram alimentados com soro imune. Foram também identificados, por DDRT-PCR, dois genes de P. yoelii yoelii e oito de A. stephensi, cuja expressão foi alterada pela segunda alimentação sanguínea e/ou pelo tratamento com soro imune. Quando a expressão foi analisada por qRT-PCR observaram-se diferenças estatisticamente significativas, na expressão de alguns genes nos diferentes grupos de tratamento. No decurso deste trabalho foi testado um método para a cultura de oocinetos de Plasmodium falciparum. Embora se tenham obtido oocinetos, o seu número era insuficiente para utilização em experiências subsequentes e o método não foi implementado. Para determinar o impacto de uma infecção mista no desenvolvimento parasitário no mosquito foram realizadas infecções experimentais com P. falciparum e/ou Plasmodium vivax. Mosquitos Anopheles albimanus, foram infectados por alimentação artificial de membrana, com sangue de doentes infectados com apenas uma das espécies. A realização de infecções experimentais e recolha de material biológico foi feita em Buenaventura e Cali, na Colômbia. Analisou-se a dinâmica de infecção nos mosquitos, assim como a resposta de alguns genes do seu sistema imunológico a infecções simples e mistas, com ambas as espécies. Os resultados obtidos para a dinâmica de infecções não mostrou nenhum efeito evidente de uma espécie sobre a outra, no entanto tratou-se de um estudo preliminar. Verificou-se que alguns dos genes estudados parecem responder à infecção e foram também observados padrões de expressão diferentes de acordo com o tipo de infecção. Observou-se o aumento de expressão de alguns genes, sendo mais evidente no corpo gordo, especialmente na altura de libertação de esporozoítos do oocisto. No intestino médio, a cecropina 3 foi o gene cuja expressão foi mais alterada, verificando-se um aumento de expressão às 24 horas, altura em que se dá a invasão do epitélio pelos oocinetos. Alguns dos factores analisados mostraram ter um efeito no desenvolvimento esporogónico de Plasmodium, podendo esse efeito ser directo no parasita ou indirecto afectando a resposta do mosquito à infecção. Verificaram-se alterações na expressão génica quer em Plasmodium quer em Anopheles como resposta às diferentes variantes experimentais mas estudos mais específicos são necessários para aferir os mecanismos moleculares subjacentes aos efeitos observados e o seu impacto em medidas de controlo da malária. Plasmodium sporogonic development and transmission to the mosquito are important targets for the design or improvement of transmission control methods. At this stage, the parasite has to face adverse conditions caused both by bloodmeal and mosquito factors and the greatest losses of parasite numbers are observed. Thus, artificial manipulation of these conditions could lead to a significant reduction of malaria transmission. Several factors of the blood meal could diminish or increase transmission, such as antibodies, drugs, multiple blood meals or the presence of more than one genotype or species of parasites. Also, the environment of the midgut is harsh, due to both blood meal digestion and effective immune response mounted by the mosquito. Several research lines were pursued aiming at contribute to the knowledge of how some of these factors can affect mosquito development. Infection rate and intensity were accessed in Anopheles stephensi mosquitoes after a second blood meal with and without immune sera from Rattus rattus or Mus musculus (BALB/c), containing antibodies anti-Plasmodium yoelii yoelii sporozoite. DDRT-PCR and qRT-PCR methods were used to identify and evaluate changes in the expression of parasite and mosquito genes. Both infection rate and intensity were significantly reduced when mosquitoes were fed with immune serum. Also, two P. yoelii yoelii and eight A. stephensi genes, whose expression was altered by the second blood meal, with or without immune serum, were isolated by DDRT-PCR. When the expression of these genes was further analysed by qRT-PCR, significant differences in genes expression was observed for some of the genes, in different treatment groups. A new method for the in vitro cultivation of Plasmodium falciparum ookinetes was also tested but ookinete production was insufficient to use in subsequent experiments and the method was not implemented. To determine the impact of mixed infection in the parasite development in the mosquito, experimental infections of Anopheles albimanus, with P. falciparum and/or Plasmodium vivax, were performed. The mosquitoes were infected by membrane artificial feeding with blood from patients infected with one of those species. The experimental infections and biologic material collection were done in Buenaventura and Cali, Colombia. Infection dynamics and expression of some genes involved in the immune system were analysed in single and mixed infections. Regarding infection dynamics, there was no evident effect of one species over another but this was only a preliminary study. Some of the studied genes seemed to respond to infection and different expression patterns were observed according to the type of infection. Some genes showed higher expression and this was observed mostly at the fat body at the time the sporozoites were being released by the oocyst. At the midgut, cecropin 3 displayed the higher expression changes in response to infection, at 24 hours post-infection, the time at which ookinete epithelium invasion occurs. In this study, we observed that some of the studied factors were proved to have an effect on the Plasmodium sporogonic development, affecting directly the parasite or indirectly by affecting mosquito physiologic functions. Expression changes of some genes were observed, both in Plasmodium and Anopheles, as a consequence of different experimental treatments. Further specific studies are necessary to identify the molecular mechanisms behind the observed effects and their possible impact in malaria control. |
