Study of genetic sequences associated with extracellular lipases of Candida palmioleophila for their expression in Kluyveromyces lactis
| Autor: | Acevedo-Castro, Mayra Alejandra |
|---|---|
| Přispěvatelé: | Valdivieso-Quintero, Wilfredo, Hernández-Peñaranda, Indira Paola, Rondón-Villarreal, Nydia Paola, Fajardo-López, Mónica, Zafra-Sierra, Germán Alexis |
| Jazyk: | Spanish; Castilian |
| Rok vydání: | 2022 |
| Předmět: | |
| Zdroj: | Repositorio Universidad de Santander Universidad de Santander instacron:Universidad de Santander |
| Popis: | Digital La levadura C. palmioleophila tiene capacidad para degradar grasas y aceites en el tratamiento de efluentes residuales de la refinación del aceite de palma (Agualimpia et al., 2016; Rodríguez et al., 2016). Recientemente se realizó el estudio del genoma de C. palmioleophila (datos no publicados) en el que se identificaron 8 secuencias de ADN que guardaban identidad con lipasas extracelulares de otras especies del género Candida. Teniendo en cuenta la importancia de las lipasas en la industria de alimentos, agrícola, farmacéutica y cosmética, el presente trabajo tuvo como objetivo estudiar secuencias genéticas asociadas a lipasas extracelulares de Candida palmioleophila para su expresión en Kluyveromyces lactis. Para ello, se realizó la caracterización in silico de las secuencias mediante la búsqueda de atributos asociados a lipasas extracelulares tales como la presencia de sitio activo, péptido señal y la comparación de modelos predictivos con estructuras cristalográficas reportadas. Se seleccionó la secuencia de ADN denominada Sec6 que codifica para una proteína de 205 aminoácidos y en cuya secuencia de aminoácidos se encontró péptido señal, el motivo acil hidrolasa y el posible sitio activo de las lipasas, adicionalmente los modelos generados presentaron una identidad del 48.96 % con la lipasa 4 de Candida viswanatti y una similitud estructural con la lipasa A de Candida antarctica con un RSMD de 0.83. La secuencia de ADN fue optimizada para su expresión en K. lactis por medio del vector pKLAC2. El mejor transformante de lipasa recombinante sec6 de Candida palmioleophila codificante de una proteína de 22.5 kDa, produjo 289.46 de proteína parcialmente purificada del cultivo suplementado con galactosa 2% como inductor. Su expresión fue favorecida al aumentar el tiempo de cultivo, pero no la cantidad de inductor. La actividad de la proteína derivada de la secuencia Sec6, mostró actividad de lipasa en medio suplementado con aceite de oliva y actividad enzimática de 17.3 U/mg de proteína en la hidrólisis del p-nitrofenil acetato. Los resultados presentados permitieron evidenciar la expresión heteróloga de la lipasa (Sec6) de Candida palmioleophila y la categorización de las secuencias codificantes para trabajos posteriores dirigidos a la expresión de otras lipasas, el estudio de otros factores que afecten su actividad enzimática y las posibles aplicaciones biotecnológicas de las lipasas recombinantes de Candida palmioleophila. The yeast C. palmioleophila has the capacity to degrade fats and oils in the treatment of residual effluents from palm oil refining (Agualimpia et al., 2016; Rodríguez et al., 2016). A study of the genome of C. palmioleophila (unpublished data) was recently carried out, in which 8 DNA sequences were identified that were identical with extracellular lipases from other species of the genus Candida. Taking into account the importance of lipases in the food, agricultural, pharmaceutical and cosmetic industries, the present work aimed to study genetic sequences associated with extracellular lipases from Candida palmioleophila for their expression in Kluyveromyces lactis. For this, the in silico characterization of the sequences was carried out by searching for attributes associated with extracellular lipases such as the presence of an active site, signal peptide and the comparison of predictive models with reported crystallographic structures. The DNA sequence called Sec6 was selected, which codes for a protein of 205 amino acids and in whose amino acid sequence signal peptide, the acyl hydrolase motif and its possible active site of lipases were found, additionally the generated models presented an identity of 48.96% with lipase 4 from Candida viswanatti and a structural similarity with lipase A from Candida antarctica with an RSMD of 0.83. The DNA sequence was optimized for its expression in K. lactis by means of the pKLAC2 vector. The best transformant of Candida palmioleophila recombinant lipase sec6 encoding a 22.5 kDa protein, produced 289.46 ug/mL of partially purified protein from culture supplemented with 2% galactose as inducer. Its expression was favored by increasing the culture time, but not the amount of inducer. The activity of the protein derived from the Sec6 sequence showed lipase activity in medium supplemented with olive oil and enzymatic activity of 17.3 U/mg of protein in the hydrolysis of pnitrophenyl acetate. The presented results allowed to evidence the heterologous expression of the lipase (Sec6) of Candida palmioleophila and the categorization of the coding sequences for later works directed to the expression of other lipases, the study of other factors that affect their enzymatic activity and the possible biotechnological applications of recombinant lipases from Candida palmioleophila. Maestría Magíster en Biotecnología 1. Introducción ...................................................................................................................... 20 2. Planteamiento del Problema .............................................................................................. 22 3. Pregunta de Investigación ................................................................................................. 24 4. Justificación....................................................................................................................... 25 5. Marco Teórico ................................................................................................................... 28 5.1. Lipasas............................................................................................................................... 28 5.1.1. Propiedades y Características .......................................................................................... 28 5.1.2. Microorganismos Productores.......................................................................................... 30 5.1.3. Aplicaciones Biotecnológicas. .......................................................................................... 31 5.2. Candida palmioleophila .................................................................................................... 33 5.3. Caracterización Bioinformática de Proteínas .................................................................... 34 5.4. Expresión Heteróloga de Proteínas ................................................................................. 35 5.4.2. Kluyveromyces lactis Como Sistema de Expresión ........................................................ 35 5.5. Purificación de Proteínas ................................................................................................ 41 5.5.1. Purificación de Proteínas Por Cromatografía de Intercambio Iónico ........................... 41 6. Marco Referencial .......................................................................................................... 44 7. Objetivos ......................................................................................................................... 48 7.1. Objetivo General ............................................................................................................. 48 7.2. Objetivos Específicos. .................................................................................................... 48 8. Metodología .................................................................................................................... 49 8.1. Caracterización de Secuencias. ....................................................................................... 49 8.1.1. Identificación de marcos de lectura e identidad con lipasas extracelulares reportadas en secuencias de C. palmioleophila. ................................................................................................. 49 8.1.2. Extracelulares ............................................................................................................................... 50 8.2. Diseño de Oligonucleótidos ............................................................................................ 51 8.3. Microorganismos y Condiciones de Cultivo .................................................................. 52 8.4. Obtención de ADN ......................................................................................................... 53 8.5. Amplificación Por PCR .................................................................................................. 54 8.6. Expresión Heteróloga. .................................................................................................... 55 8.6.1. Optimización de Codones y Síntesis de Secuencia ......................................................... 56 8.6.2. Transformación de E. coli OneShot TOP10. .................................................................. 56 8.6.3. Transformación de Kluyveromyces lactis GG799. ......................................................... 57 8.7. Producción de la Proteína Recombinante y Evaluación de la Actividad de Lipasa. ...... 59 8.7.1. Evaluación de Condiciones de Producción de la Proteína Recombinante. ................... 60 8.7.2. Fraccionamiento del Concentrado Proteico. ................................................................. 61 8.7.3. Actividad Lipolítica Medida Por Difusión en Agar Rodamina B. .................................. 63 8.7.4. Ensayo de Liberación de p-nitrofenol ............................................................................ 64 9. Resultados y discusión .................................................................................................... 65 9.1. Caracterización de secuencias asociadas a lipasas extracelulares de Candida palmioleophila .............................................................................................................................. 65 9.1.1. Identificación de marcos de lectura e identidad con lipasas extracelulares reportadas en secuencias de C. palmioleophila. ................................................................................................. 65 9.1.2. ............................. 69 9.2. Amplificación Del Fragmento de Seq 6 Por PCR. ......................................................... 74 LIPASAS EXTRACELULARES DE Candida palmioleophila | 10 9.3. Aseguramiento del Vector de Expresión pKLAC2-Sec6 ............................................... 76 9.4. Transformación de Kluyveromyces lactis GG799 Para la Expresión de Sec6................ 77 9.5. Expresión de Proteína Recombinante Extracelular de Candida palmioleophila ............ 80 9.5.1. Fraccionamiento de la Proteína ..................................................................................... 84 9.6. Actividad Enzimática ...................................................................................................... 88 9.6.1. Método en Placa Con Rodamina B ................................................................................ 88 9.6.2. Ensayo de p-nitrofenol .................................................................................................... 89 10. Conclusiones ................................................................................................................... 91 11. Recomendaciones ........................................................................................................... 93 12. Referencias Bibliográficas .............................................................................................. 94 13. Apéndice ....................................................................................................................... 134 |
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