Analysis of transcriptional and post-transcriptional regulation of DUSP4, a human gene associated with colorectal cancer (CRC)

Autor: Varela, Tatiana
Přispěvatelé: Laizé, Vincent, Conceição, Natércia
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2017
Předmět:
Zdroj: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
instacron:RCAAP
Popis: Dissertação de mestrado, Biologia Molecular e Microbiana, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2017 Colorectal cancer (CRC) is the third most common type of cancer and the fourth leading cause of death worldwide. Dual specificity phosphatase 4 (DUSP4) – a regulator of the mitogen-activated protein kinase activity – has been recently associated with CRC after its expression was found to be up-regulated in tumour tissue. However, expression data are limited and mechanisms underlying DUSP4 regulation poorly understood. Objectives of this work were to collect basic data on the expression of the different transcript variants in CRC samples and on the transcriptional and post-transcriptional regulation of human DUSP4. The expression of transcript variants 1, 2 and X1 was determined by qPCR in tumour and TAN tissues from 28 patients. All transcripts were overexpressed in tumour tissues, although to different extents. Variant X1 was the most up-regulated (>13 folds) and associated with several clinicopathological parameters (KRAS mutation and poorly differentiated tumour). DUSP4 transcript overexpression was also found to be possibly associated with a reduced overall survival and a more severe tumour stage. DUSP4 promoters activity was assessed using reporter promoter constructs and vectors expressing cancer-related transcription factors. While CTCF and FOXA1 regulated promoter#2 activity (i.e. transcription of variants 2 and X1) and STAT3 promoter#1 activity (i.e. the transcription of variant 1), SP1 and YY1 regulated both promoter activity, although to different extent. Preliminary data collected from the in silico analysis of DUSP4 3’-UTR revealed putative binding sites for miR-137, a microRNA acting as tumour suppressor in several cancers, including CRC. In conclusion, DUSP4 transcripts are all overexpressed in CRC tissues and have therefore the potential to serve as disease markers, especially variant X1. DUSP4 expression is regulated by cancer-related transcription factors in a promoter-specific manner, i.e. the expression of variant 1 and variants 2/X1 is controlled by different regulatory mechanisms, although up-regulated in a CRC context. Existem mais de duzentos tipos diferentes de cancro, podendo-se desenvolver em qualquer parte do corpo humano. O cancro colorretal (CCR) é o terceiro tipo de cancro mais comum em todo o mundo, após o cancro do pulmão e da mama, com aproximadamente 1,3 milhões de novos casos diagnosticados por ano, e a quarta causa principal de morte relacionada com o cancro, sendo responsável por cerca de 690 mil mortes por ano no mundo. Em Portugal, é o segundo tipo de cancro mais frequente, sendo que a mortalidade associada ao CCR tem vindo a aumentar constituindo um problema crescente na nossa sociedade. Relativamente às suas características moleculares, manifestações clínicas, sensibilidade aos tratamentos e prognóstico, o CCR é uma doença complexa e heterogénea, que se desenvolve de uma forma lenta, nas células epiteliais do revestimento do cólon ou do reto, como consequência da acumulação progressiva de alterações genéticas e epigenéticas em genes envolvidos na proliferação celular, diferenciação e reparação do ADN. As principais vias envolvidas na patogénese do CCR são a via de instabilidade cromossómica (CIN), a via de instabilidade de microssatélites (MSI) e a via do fenótipo metilador de ilhas CpG (CIMP), embora a via mais comum e melhor caracterizada seja a CIN, sendo identificada em quase 85% de todos os casos. Existem três padrões de ocorrência do CCR: esporádico (70-85% dos casos), hereditário e familiar. Não existe uma causa específica para o CCR, no entanto, vários fatores de risco estão associados ao seu desenvolvimento, incluindo fatores genéticos e ambientais. O risco de desenvolver CCR aumenta com a idade, sendo que mais de 90% dos casos são diagnosticados em indivíduos com mais de 50 anos, embora a sua incidência esteja a aumentar entre as pessoas mais jovens. Recentemente, a proteína DUSP4 (fosfatase de dupla especificidade 4) tem sido associada a mecanismos de doenças, inclusivamente no cancro. Esta fosfatase regula negativamente a atividade das MAPKs (proteínas quinase ativadas por mitógenos), que desempenham um papel crucial na proliferação e diferenciação celular e apoptose, através da desfosforilação de ambos os resíduos fosfoserina/treonina e fosfotirosina. A proteína DUSP4 é localizada estritamente no núcleo e expressa em diversos tecidos, tais como: mama, cérebro, pulmão, cólon e reto. Existem evidências de que a expressão do DUSP4 é desregulada em alguns tumores, como por exemplo no CCR. Vários estudos mostraram a sobre-expressão do DUSP4 em tecidos e linhas celulares de cancro colorretal em comparação com tecidos e linhas celulares normais. No entanto, se a DUSP4 funciona como um supressor de tumor ou um promotor de tumor ainda é controverso. Uma vez que, os dados sobre a expressão do DUSP4 são limitados e os mecanismos subjacentes à sua regulação são pouco compreendidos, são necessários mais dados para decifrar a complexidade dos mecanismos subjacentes ao papel do DUSP4 no CCR e a identificação de fatores que regulam a expressão do DUSP4 ao nível transcricional e pós-transcricional representa um passo importante para uma melhor compreensão desses mecanismos. Portanto, o objetivo principal deste trabalho consistiu em analisar a expressão dos diversos transcritos do DUSP4 num conjunto de amostras humanas de CCR e correlacioná-la com fatores clinico-patológicos, e coletar dados valiosos sobre a regulação transcricional e pós-transcricional do DUSP4 humano. A expressão dos transcritos 1, 2 e X1 do DUSP4 foi determinada por qPCR em tecidos colorretais de nove pacientes saudáveis e em tecidos normais associados ao tumor (TAN) e tumorais de 28 pacientes com cancro colorretal. Os resultados mostraram que todos os transcritos analisados estavam significativamente sobre-expressos (p 13 vezes) e também o que apresentou mais associações com parâmetros clinico-patológicos do CCR (mutação no gene KRAS e tumor pouco diferenciado). Apesar de não ser estatisticamente significante, a sobre-expressão de todos os transcritos parece ter sido associada a uma reduzida sobrevivência e a um estadio tumoral mais grave. Para determinar a significância destas associações, deverá ser avaliado um maior conjunto de amostras. A análise funcional das duas regiões promotoras do DUSP4 (promotor 1 – montante do exão 1; promotor 2 – montante do exão 2), que provavelmente levam à transcrição das diferentes variantes, foi realizada através de transfecções transientes, em células HEK-293, usando construções contendo os fragmentos das duas regiões promotoras a montante do gene da luciferase. Embora numa extensão diferente, ambas as regiões promotoras do DUSP4 mostraram serem funcionais pois induziram a transcrição do gene da luciferase. Efetuou-se uma análise in silico que indicou a possível presença de sequências de reconhecimento de fatores de transcrição relacionados com o cancro nestas regiões promotoras do DUSP4. A funcionalidade de vários destes locais de ligação foi confirmada in vitro, através de co-transfecções das construções repórter contendo cada fragmento dos promotores com vetores de expressão contendo cada fator de transcrição. Os nossos resultados mostraram que, enquanto o CTCF ativou e o FOXA1 reprimiu, especificamente, as construções do promotor 2 (levando à transcrição das variantes 2 e X1), o STAT3 regulou positivamente o promotor 1 (levando à transcrição da variante 1). O SP1 e YY1 regularam positivamente construções de ambos os promotores, embora as do promotor 2 numa maior dimensão. A análise in silico da região 3'-UTR do DUSP4 identificou locais de ligação putativos promissores para o miR-137, um microRNA que tem sido implicado como um supressor de tumor em vários tipos de cancro, inclusivamente no cancro colorretal. Em conclusão, todas os transcritos do DUSP4 analisados neste estudo (1, 2 e X1) encontraram-se sobre-expressos em tecidos de cancro colorretal, em comparação com as amostras de tecido normal dos mesmos pacientes e, portanto, têm potencial para servir como marcadores da doença, especialmente a variante X1. A expressão do DUSP4 é regulada de uma forma específica por fatores de transcrição relacionados com o cancro, isto é, a expressão da variante 2 e das variantes 2/X1 são controladas por diferentes mecanismos reguladores. Portanto, no âmbito deste trabalho foram obtidos dados valiosos sobre a expressão dos diversos transcritos do DUSP4 em amostras de CCR, que no nosso melhor conhecimento consistiu no primeiro estudo a avaliá-las separadamente, e sobre a regulação transcricional e pós-transcrição do DUSP4.
Databáze: OpenAIRE
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