Extremophilic microorganisms from natural and artificial environments: Bioprospecting and Biotechnological Applications
| Autor: | Satari Faghihi, Leila |
|---|---|
| Přispěvatelé: | Porcar Miralles, Manuel, Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Jazyk: | angličtina |
| Rok vydání: | 2022 |
| Předmět: | |
| Zdroj: | RODERIC. Repositorio Institucional de la Universitat de Valéncia instname |
| Popis: | La Tierra es el hogar de una gran biodiversidad de microorganismos, que recientemente se ha estimado en 10(12) o más taxones microbianos que habitan nuestro planeta. Durante décadas, se han explorado los ambientes naturales para estudiar sus comunidades microbianas, así como los mecanismos de adaptación específicos de las especies que los componen y sus potenciales aplicaciones biotecnológicas. No solo los entornos naturales sino también los artificiales tienen interés como fuentes de diversidad microbiana. Investigaciones anteriores sobre el microbioma de los productos hechos por el hombre revelaron que los dispositivos artificiales con un diseño y un procedimiento de operación estándar representan presiones selectivas particulares, como ocurre con los paneles solares, cafeteras, lavadoras, lavavajillas, sistemas de refrigeración por aire y sistemas de calentamiento de agua, que dan como resultado la selección de un microbioma que no cambia significativamente dentro de las variaciones geográficas o climáticas. Sin embargo, esos ambientes artificiales y sus comunidades microbianas han recibido poca atención. En la presente tesis doctoral, estudiamos el microbioma de varios ambientes artificiales y semiartificiales, especialmente aquellos con presiones selectivas particulares como la desecación, la radiación ultravioleta, la salinidad, la privación de nutrientes, las temperaturas extremas, la actividad de agua y las variaciones de pH. Nuestros resultados mostraron que, además del microbioma asociado al ser humano, que puede constituir una fracción considerable de los dispositivos artificiales, los consorcios microbianos ambientales no patógenicos acabn estableciéndose en esos ambientes. Entre todas esas comunidades microbianas, algunas especies son extremófilas y algunas pueden tolerar las condiciones extremas de su entorno, albergando una variedad de mecanismos de supervivencia, como la esporulación y/o la formación de biopelículas. Algunos otros han desarrollado evolutivamente mecanismos adaptativos intercelulares e intracelulares para hacer frente a las duras condiciones ambientales. Objetivos El objetivo de esta tesis doctoral es caracterizar las comunidades microbianas de algunos ambientes artificiales y semiartificiales que se encuentran bajo constantes presiones selectivas particulares tales como irradiación UV, desecación, salinidad, privación de nutrientes, baja temperatura y disponibilidad de oxígeno. Para ello, se utilizaron análisis NGS y culturómicos para describir las comunidades microbianas asociadas con chicles desechados, sales de mesa y la máquina de hielo de un laboratorio. Además, estudiamos la sucesión de la comunidad microbiana en la colonización de productos sintéticos como la goma de mascar desechada. Se identificaron especies microbianas asociadas con productos artificiales como goma de mascar, sales de mesa y dispositivos completamente manufacturados, como la máquina de hielo, y hemos discutido su potencial para aplicaciones biotecnológicas. También aislamos y caracterizamos microorganismos individuales de esos ambientes utilizando medios y métodos estándar para determinar su actividad biológica. Una nueva especie del género Sagittula, previamente aislada del desecho marino (una lata de aluminio) se caracterizó mediante enfoques fenotípicos multiómicos. Capítulo I - Metodología, resultados y discusión En esta disertación, hemos estudiado el bacterioma de los chicles desechados, los cuales son a menudo desechados indebidamente en calles, terrazas, aceras o pavimentos exteriores de cualquier tipo. Generalmente, los chicles se componen de dos fases: la fase insoluble en agua (base de goma) y la fase soluble en agua, que puede estar hecha de azúcar o alcoholes de azúcar como polioles. El componente principal de cualquier goma de mascar es la base de goma (20-30 %), que no es comestible ni digerible, se puede producir a partir de polímeros naturales o sintéticos y tiene propiedades similares a las del plástico. Los chicles desechados a menudo se consideran contaminantes ambientales y tienen además un componente estético muy negativo. Estudios anteriores muestran que el ADN del consumidor y el microbioma oral pueden quedar atrapados en el residuo pegajoso, pero la supervivencia del microbioma oral a lo largo del tiempo solo ha recibido una atención limitada hasta la fecha. Por primera vez, hemos estudiado el contenido microbiano de los chicles desechados muestreados en diferentes lugares del mundo, así como la distribución de bacterias según la profundidad (en tres fases: la superficie, la capa intermedia y la base del chicle, en contacto con el sustrato) y hemos realizado un estudio dinámico para descubrir la sucesión microbiana que tiene lugar en el chicle durante las primeras semanas después de que sea descartado en una superficie al aire libre. Además, hemos evaluado la capacidad de biodegradación de los ingredientes de la goma de mascar de una colección de cepas bacterianas que aislamos de los residuos de la goma de mascar. Las sucesiones microbianas a partir del bacterioma oral atrapado en el proceso de masticación en la goma de mascar desperdiciada mostraron que el bacterioma oral fue gradualmente sustituido, en los chicles descartados sobre el pavimento, por bacterias ambientales durante tres meses de exposición al aire libre. Mientras que el grupo del microbioma salival se detectaron principalmente como géneros predominantes Streptococcus, Corynebacterium, Haemophilus y Rothia, bacterias ambientales transportadas por el aire como Acinetobacter spp., Sphingomonas spp. Pseudomonas spp. y Rubellimicrobium spp. colonizaron la goma de mascar desperdiciada transcurridas varias semanas. De hecho, el microbioma oral presente en los chicles recién masticados primero fue sustituido por taxones transitorios como Cellulomonas spp. y Rubellimicrobium, que no persistieron hasta el final del experimento. Es interesante recalcar que Cellulomonas spp. se ha descrito por las capacidades de secretar múltiples enzimas degradadoras de polisacáridos. Por tanto, se puede plantear la hipótesis de que estos colonizadores primarios del chicle desperdiciado pueden modificar las características de la superficie, permitiendo la colonización posterior de microorganismos secundarios. Curiosamente, varios chicles desechados recolectados en todo el mundo contienen un típico bacterioma ambiental de biopelícula subaérea, caracterizado por especies como Sphingomonas spp., Kocuria spp., Deinococcus spp. y Blastococcus spp., que están habitualmente presentes en ambientes naturales y artificiales expuestos al sol, como paneles solares, y que suelen estar caracterizados por la formación de biofilms o biopelículas. La biopelícula permite que la población microbiana afronte mejor el estrés y se vuelva más resistente a las condiciones ambientales desfavorables, como la baja actividad del agua y la privación de nutrientes. Además, algunos de los miembros de esos géneros pueden degradar las cadenas aromáticas policíclicas que forman parte de la base de la goma. En nuestrio trabajo, se estableció una colección de cepas bacterianas de chicles desechados y se analizó la capacidad de biodegradación de diferentes ingredientes de chicles por parte de los aislados. Nuestros resultados sugieren que la bioaumentación de algunas de las cepas que caracterizamos puede usarse como una estrategia de biorremediación para eliminar los residuos de chicle de los pavimentos contaminados. También mostramos que no hay diferencias significativas en términos de las comunidades microbianas de las diferentes capas de chicle, lo que sugiere que las propiedades fisicoquímicas de un chicle no cambian a lo largo de su profundidad y los factores selectivos como son la radiación de UV y la actividad del agua forman una comunidad bacteriana particular. En conjunto, nuestros resultados sugieren que las bacterias ambientales desempeñan un papel en la biodegradación natural de la goma de mascar y también pueden ser una fuente de cepas con propiedades de biodegradación. Esta investigación fue el primer informe que caracterizó, desde un enfoque holístico, la composición bacteriana del chicle desechado, y recibió el premio IgNobel de ecología a las investigaciones sorprendentes en septiembre de 2021. Capítulo II - Metodología, resultados y discusión También estudiamos el microbioma de otro entorno semiartificial, las sales de mesa, producidas en diferentes salinas marinas y continentales. En los hábitats salinos naturales, las arqueas y las bacterias halófilas son las comunidades microbianas predominantes. Esos ambientes salinos son en los que se produce, por cristalización, la sal de mesa comercial. La mayoría de las sales comerciales se refinan y se muelen finamente antes de su distribución. Por lo tanto, esos microorganismos pueden quedar atrapados en las inclusiones fluidas durante el proceso de cristalización y seguir siendo viables después de la extracción y el envasado. Hay muy pocos informes sobre el microbioma de la sal de mesa y tienden a centrarse en los taxones de arqueas. Sin embargo, el presente trabajo describe una caracterización completa del bacterioma de dichas sales, donde se estudió la diversidad de microorganismos halotolerantes y halófilos en seis muestras comerciales de sal de mesa mediante técnicas dependientes e independientes del cultivo. Se obtuvieron tres sales de mesa de origen marino: del Océano Atlántico, del Mediterráneo (Isla de Ibiza) y de las marismas del Odiel (sal marina de Mercadona). También se utilizaron otras sales complementadas con ingredientes minerales y nutricionales: sal rosa del Himalaya, sal negra de Hawai y una sal vegetal seca conocida como sal Vikinga. Independientemente del origen de las sales, las especies de géneros bacterianos como Flavobacterium, Bacillus y Yoonia-Loktanella fueron los taxones más abundantes, mientras que las arqueas más frecuentes fueron Natronomonas, Halolamina, Halonotius, Halapricum, Halobacterium, Haloarcula y Halobacterales. Curiosamente, los resultados de la secuenciación del gen 16S rRNA revelaron que las sales de origen marino muestran una taxonomía de arqueas similar, pero con variaciones significativas entre los géneros. Los taxones Halorubrum, Halobacterium, Hallobellus, Natronomonas, Haloplanus, Halonotius, Halomarina y Haloarcula prevalecieron en las sales marinas. Además, el género Salinibacter se detectó solo en sales de origen marino. La sal rosa del Himalaya, la sal negra de Hawai y la sal Vikinga mostraron perfiles taxonómicos más heterogéneos dominados por bacterias. Estas sales no marinas a menudo se enriquecen con minerales o saborizantes adicionales, como hierro, sulfato de hidrógeno, carbón activo y vegetales secos. La sal del Himalaya se extraía de las estribaciones de la cordillera del Himalaya que alguna vez fueron mares. El género más importante en esta muestra fue Sulfitobacter. Podría plantearse la hipótesis de que Sulfitobacter aparece en una cantidad tan significativa en esta muestra debido a la actividad que muestra este género para oxidar los sulfitos, que están presentes en altas concentraciones en la región del Himalaya. Otra muestra del grupo no marino es la sal Vikinga, que presenta una alta frecuencia de cloroplastos (más del 66 % de su perfil taxonómico) y mitocondrias (4.7 % del total), lo que puede ser consecuencia de su composición actual (contiene diferentes vegetales). El género Bacillus también estuvo presente en esta muestra. Este género contiene ciertas especies tolerantes a la sal. Además, se puede suponer que las bacterias que se originan a partir de minerales o sabores adicionales se inocularon en la sal durante el proceso de producción. Además, existen otras posibles explicaciones para la prevalencia de bacterias sobre arqueas en esas muestras. De hecho, la sal enriquecida con vegetales secos tiene menos contenido de cloruro de sodio. La alta salinidad (por encima del 20 - 25 % p/v de NaCl) es el factor principal para la supervivencia de las haloarqueas. Por lo tanto, la salinidad como factor abiótico es la principal presión selectiva para establecer la población microbiana en los paquetes de sal de mesa junto con la presencia de otros ingredientes. Como era de esperar, aislamos cepas de las sales de mesa que estaban estrechamente relacionadas con bacterias (en general, moderadamente) halófilas. Se estableció una colección de 76 especies de bacterias y haloarqueas halotolerantes y halófilas mediante el cultivo en diferentes medios con una amplia gama de salinidad y composición de nutrientes. La comparación de los resultados de la metataxonómica y la culturómica del gen 16S rRNA reveló que los microorganismos cultivables Acinetobacter, Aquibacillus, Bacillus, Brevundimonas, Fictibacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Micrococcus, Oceanobacillus, Salibacterium, Salinibacter, Terribacillus, Thalassobacillus, Haloarcula, Halobacterium y Halorubrum se identificaron al menos en una muestra por ambos métodos. Aunque la mayor parte del microbioma de las sales de mesa eran bacterias halófilas y arqueas, algunos microorganismos potencialmente patógenos como Enterococcus sp. y Brevundimonas sp. se identificaron en casi todas las muestras, mientras que bacterias potencialmente consideradas como beneficiosas como Lactobacillus sp. solo se detectaron en algunas sales de mesa. Esto sugiere que la sal de mesa puede ser una fuente de algunas de las bacterias halotolerantes que se caracterizan como microorganismos promotores de la salud o patógenos, cuya conexión con la salud del consumidor debería recibir más atención. Por otro lado, se ha monitorizado la producción de carotenoides en una variedad de bacterias y arqueas aisladas. La mayoría de los microorganismos aislados de la sal de mesa son productores de carotenoides. Los carotenoides son pigmentos que pueden ser incoloros, amarillos, naranjas o rojos, y están constituidos principalmente por isoprenoides lipofílicos C40, como compuestos antioxidantes y desempeñan un papel crucial en la protección de las células, especialmente al reducir los hidroperóxidos en compuestos estables, prevenir la formación de radicales libres, inhibir la reacción en cadena de auto-oxidación y en la irradiación de alta intensidad mediante la extinción del oxígeno monoatómico. Además, los carotenoides pueden actuar como quelantes de metales y convertir los iones tóxicos de hierro y cobre en moléculas no tóxicas. Parece que, en un entorno de estrés múltiple como la sal de mesa, la producción de pigmento podría ser un mecanismo de supervivencia, especialmente para los microorganismos halotolerantes, frente a la salinidad y la desecación y probablemente evitar que las células sufran daños irreversibles. Capítulo III - Metodología, resultados y discusión Además de los alimentos o residuos alimentarios, los dispositivos artificiales pueden albergar poblaciones microbianas potencialmente interesantes. En esta tesis, también estudiamos el microbioma de una máquina de hielo de laboratorio estándar, cuya bomba de extracción de agua estaba obstruida por una biopelícula espesa y gomosa. Describimos la composición de esta comunidad microbiana oligotrófica que habita este dispositivo a través de técnicas independientes y dependientes de la cultura. Mediante el uso de culturómica en ocho medios diferentes a tres temperaturas psicrófilas y mesófilas, se aislaron e identificaron taxonómicamente 25 cepas microbianas diferentes. Las cepas bacterianas aisladas de la biopelícula de máquina de hielo están estrechamente afiliadas a los géneros Acidovorax, Bacillus, Chryseobacterium, Delftia, Flavobacterium, Hydrogenophaga, Methylobacterium, Nocardia, Peribacillus, Pseudomonas, Prolinoborus, Rhodococcus, Sphingomonas. A nivel de especie los hongos también se identificaron como Aspergillus austroafricanus, Cadophora luteo-olivacea, Briansuttonomyces eucalypti, Filobasidium magnum, Neomicrosphaeropsis italica, Penicillium citrinum y Vishniacozyma victoriae. Entre todos, se observó una mayor diversidad de cepas microbianas a 25 ºC frente a otras temperaturas de incubación; 4 y 10 ºC. Aquí, la esporogénesis puede desempeñar un papel clave, ya que algunas especies estrechamente relacionadas con las cepas presentes en la tubería de drenaje de la máquina de hielo, como los géneros Bacillus y Peribacillus, se han descrito anteriormente como bacterias formadoras de esporas. Una posible explicación de la mayor biodiversidad de las especies aisladas a 25 ºC en comparación con las otras dos temperaturas puede estar relacionada con la alta abundancia relativa de bacterias formadoras de esporas en la biopelícula. El análisis de secuenciación de alto rendimiento 16S rRNA e ITS reveló que Bacteroidota y Proteobacteria eran los filos bacterianos más abundantes en la muestra, seguidos de Acidobacteriota y Planctomycetota, mientras que la comunidad fúngica estaba claramente dominada por la presencia de un género desconocido de la familia Didymellaceae. A nivel de género, la comunidad bacteriana se caracterizó por la presencia de Sediminibacterium sp., con una abundancia relativa superior al 40 %, seguida de otros géneros, Hydrogenophaga sp. y Methyloversatilis sp. A pesar de la gran abundancia de especies de Sediminibacterium según los resultados de la NGS y las condiciones de cultivo favorables, que se utilizaron previamente para aislar Sediminibacterium spp. de otros ambientes oligotróficos, no fue posible aislar ninguna cepa de este género. Esto puede ser debido a la falta de factores abióticos específicos, como el pH ácido y la concentración de sal, que son necesarios para algunos miembros de este género, como Sediminibacterium lactis y Sediminibacterium halotolerans, respectivamente. En los ambientes de bajo contenido en nutrientes como es ciertas aguas continentales, los géneros Hydrogenophaga spp. y Methyloversatilis spp. se ha reportado que permanecen dentro de las biopelículas en lugar de en formas planctónicas. La alta abundancia de Hydrogenophaga sp. en los ecosistemas oligotróficos naturales reveló que especies de Hydrogenophaga como Hydrogenophaga laconesensis, tienen una capacidad de adaptación a la vida oligotrófica. Investigaciones anteriores también sugirieron que Hydrogenophaga sp. son capaces de hidrolizar agua, utilizando el metabolismo del hidrógeno como fuente de energía, lo que podría afectar la composición microbiana de la biopelícula. El análisis de coordenadas principales (PCoA) mostró que las muestras más similares a la biopelícula de la máquina de hielo eran dos muestras de biopelícula provenientes de depuradores de aire biológicos en una instalación de alojamiento porcino, así como una muestra de biocrust del suelo del Ártico. De hecho, a pesar de la baja similitud entre las muestras, estas cuatro muestras compartían hasta seis géneros (Pseudoxanthomonas, Ferruginibacter, unknown Comamonadaceae, Clostridium sensu stricto 1, unknown Microbacteriaceae y Brevundimonas) identificados mediante NGS, mientras que en los otros 51 géneros encontrados en el hielo el microbioma de la máquina también se encontró en al menos una de las otras muestras. Además, el análisis de diversidad alfa demostró que la muestra de la máquina de hielo, a pesar de mostrar un alto número de ASV observados, es relativamente menos diversa, es decir, más homogénea en su composición. Finalmente, las comparaciones de diversidad alfa y beta de la comunidad microbiana de la máquina de hielo con la de otros ambientes fríos revelaron una baja similitud entre las muestras. Para complementar la información taxonómica de la comunidad microbiana, también se realizó secuenciación metagenómica (shotgun). A partir de la secuenciación metagenómica de shotgun, las lecturas más frecuentes correspondieron al reino Bacteria mientras que menos de una cuarta parte correspondió a hongos. Sediminibacterium, Methyloversatilis e Hydrogenophaga también se identificaron como principales taxones de biopelículas mediante secuenciación metagenómica. Además, Stagonosporopsis sp, perteneciente a la familia Didymellaceae, fue el género más abundante entre los eucariotas. Esto está en concordancia con los resultados obtenidos del análisis de secuenciación ITS, en el que también predominaron los miembros de la familia Didymellaceae. La recuperación y el análisis de genomas ensamblados en metagenoma (MAG) de alta calidad arrojaron una tasa sorprendentemente alta de nuevas especies potenciales en la máquina de hielo. Cada MAG se clasificó taxonómicamente usando MiGA y luego se calculó el índice de Identidad Promedio de Nucleótidos (ANI) al vecino filogenético más cercano. Sorprendentemente, todas las MAG se clasificaron como especies potencialmente nuevas con un valor ANI |
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