Exploring the molecular mechanisms involved in macrophage’s response to the antimicrobial peptide LLKKK18

Autor: Cristelo, Cecília da Silva
Přispěvatelé: Gama, F. M., Coutinho, O. P., Universidade do Minho
Jazyk: angličtina
Rok vydání: 2018
Předmět:
Zdroj: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal
Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
instacron:RCAAP
Popis: Dissertação de mestrado em Genética Molecular
Tuberculosis (TB) is an infectious disease that represents a serious health problem worldwide. This condition is caused mainly by Mycobacterium tuberculosis, a bacterium that can manage to evade the immune response, surviving inside macrophages. Globally, TB incidence, prevalence and mortality are decreasing, however, drug resistance to the current treatments makes TB eradication progressively challenging. In this perspective, antimicrobial peptides, molecules used by the innate immune system to combat invading pathogens including mycobacteria, are promising candidates for TB treatment. A cathelicidin derivative peptide, LLKKK18, has recently become of great interest due to its strong antimicrobial activity and high efficiency in mycobacterial killing, which make LLKKK18 a promising alternative for TB treatment. Association of antimicrobial peptides to an intracellular drug delivery system can help to overcome the cytotoxic effects that limit the use of this peptide, while improving the delivery to target infected cells. Hyaluronic acid (HA)-based nanogels arise in this field as a suitable delivery system for LLKKK18, due to its biocompatibility and favorable internalization by cells over-expressing the CD44 receptor, such as activated macrophages. This strategy was previously used and allowed a significant reduction in mycobacteria burden in infected macrophages (Silva et al., 2017). In this project, we expect to further explore the macrophage’s response to this antimicrobial peptide, to unravel other action mechanisms that might benefit mycobacteria elimination. We aim to obtain information on the peptide effects on macrophage metabolism, phenotype and immune response to different bacterial components gaining further data on the LLKKK18 by itself or loaded in the nanogel in TB treatment. We efficiently synthesized an amphiphilic HA nanogel which allowed LLKKK18-encapsulation and internalization by macrophages. However, cytotoxicity assays revealed that the peptide-loaded nanogels had an unexpected effect causing loss of cell viability, progressively with the increased peptide concentration, in all macrophage cell models used. Cytokine release in response to different Toll-like receptor (TLR) ligands was not significantly affected by the LLKKK18-loaded nanogels and was probably affected by some of the formulation’s cytotoxic effects. When using a lower concentration of free LLKKK18 peptide, we observed a pro-inflammatory effect, enhancing predominantly the TLR4-mediated response. This suggests that in addition to LLKKK18 bactericidal activity, its pro-inflammatory effects might benefit macrophage response against mycobacteria. Further study on this subject is needed to understand the peptide’s action mechanisms and its applicability in TB treatment.
A tuberculose (TB) é uma doença infeciosa que representa um grave problema de saúde a nível mundial. Esta doença é causada maioritariamente por Mycobacterium tuberculosis, uma bactéria que consegue escapar à resposta imunitária e sobreviver no interior de macrófagos. Globalmente, a incidência, prevalência e a mortalidade associadas à TB estão em decréscimo, no entanto, a resistência aos tratamentos atualmente utilizados torna a erradicação da TB progressivamente desafiante. Nesta perspetiva, os péptidos antimicrobianos, que são moléculas utilizadas pelo sistema imunitário inato para combater agentes patogénicos, incluindo as micobactérias, são candidatos promissores para o tratamento da TB. Recentemente, um péptido derivado da catelicidina, LLKKK18, tornou-se de elevado interesse devido à sua forte atividade antimicrobiana e alta eficiência na eliminação de micobactérias, tornando-o uma alternativa promissora no tratamento da TB. Por outro lado, o desenvolvimento de um sistema de entrega intracelular destes péptidos pode permitir superar os efeitos citotóxicos que limitam o seu uso e melhorar a sua a distribuição para as células infetadas. Nesta perspetiva, o desenvolvimento de nanogéis à base de ácido hialurónico (do inglês HA) surgem como um sistema de entrega intracelular adequado para o péptido LLKKK18, devido à sua biocompatibilidade e internalização preferencial por células que sobre-expressam o recetor CD44, como é o caso dos macrófagos ativados. Esta estratégia foi anteriormente utilizada e permitiu uma redução significativa do número de micobactérias em macrófagos infetados (Silva et al., 2017). Neste projeto, ambicionamos explorar a resposta dos macrófagos a este péptido antimicrobiano, para desvendar outros mecanismos de ação que possam beneficiar a eliminação de micobactérias. Pretendemos obter informações sobre os efeitos do péptido no metabolismo dos macrófagos, no fenótipo e na resposta imunitária a diferentes componentes bacterianos, e assim obter informação mais detalhada acerca da aplicabilidade do péptido LLKKK18, por si só ou encapsulado num nanogel, no tratamento da tuberculose. Foi-nos possível sintetizar eficientemente um nanogel de HA anfifílico que permitiu a encapsulação de LLKKK18 e a internalização por macrófagos. No entanto, os ensaios de citotoxicidade revelaram que os nanogéis carregados com o péptido tiveram um efeito inesperado causando perda de viabilidade celular, progressivamente com o aumento da concentração de péptido, em todos os modelos celulares de macrófagos utilizados. A libertação de citocinas em resposta a diferentes agonistas dos Toll-like Receptor (TLR) não foi significativamente afetada pelos nanogéis carregados com LLKKK18 e foi provavelmente influenciada por efeitos citotóxicos da formulação. Ao utilizar uma menor concentração de péptido LLKKK18 livre, observamos um efeito pró-inflamatório, amplificando maioritariamente a resposta mediada por TLR4. Estes resultados sugerem que, além da atividade bactericida do péptido LLKKK18, o seu efeito pró-inflamatório pode beneficiar a resposta dos macrófagos contra micobactérias. É necessário aprofundar a investigação neste âmbito de forma a que se compreendam os mecanismos de ação do péptido e sua aplicabilidade no tratamento da tuberculose.
Databáze: OpenAIRE
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