| Popis: |
The kinetochore is a multiprotein complex that assembles on centromeric DNA and enables chromosome segregation during cell division. Essential for kinetochore assembly in most species is the histone variant CenH3 that initiates complex formation. Unexpected to this essential role, it was previously shown that CenH3 was lost in multiple insect orders including the Lepidoptera (butterflies, moths). Despite this loss, recent studies from my host lab revealed that other kinetochore homologs are present in Lepidoptera and must therefore be recruited in a different way. For my PhD I aimed to characterize the assembly of these CenH3-deficientt kinetochores in Bombyx mori cells. In order to address my aim, during the 1st and 2nd year of my PhD, I established tools and protocols in these cells with sparse experimental history. Those include the optimization of RNAI-mediated depletion, characterization of mitotic phenotypes, verification of antibodies and the generation of cell lines containing lacO arrays to able to study kinetochore assembly at ectopic sites. My studies focused on one particular kinetochore component, CENP-T that in other organisms makes important contributions to connect the kinetochore to DNA and to the spindle microtubules. Using the tools that I have generated, I could show that the B. mori CENP-T is essential for mitotic progression and both necessary and sufficient to recruit components to interact with the spindle.; Le kinétochore est un complexe multiprotéique qui s'assemble sur l'ADN centromérique et permet la ségrégation des chromosomes lors de la division cellulaire. Le variant d'histone CenH3 est essentiel pour l'assemblage des kinétochores dans la plupart des espèces où il initie leurs formation. De façon inattendue, compte tenu de leur rôle essentiel, il a été précédemment montré que CenH3 avait été perdu dans plusieurs ordres d'insectes dont les lépidoptères. Malgré cette perte, des études récentes au laboratoire ont révélé que d'autres composants du kinétochore ont des homologues chez les lépidoptères et doivent donc être recrutés de manière différente. Ma thèse a eu pour objectif de comprendre l'assemblage des kinétochores en absence de CenH3 dans des cellules de Bombyx mori. Pour cela, j'ai mis en place des outils dans ces cellules à l'histoire expérimentale sporadique. Par exemple: la déplétion d'un gène par ARNi et la validation des anticorps et la génération de lignées cellulaires contenant des répétitions lacO pour pouvoir étudier l'assemblage des kinétochores sur des sites ectopiques. Mes études se sont concentrées sur un composant particulier du kinétochore, CENP-T, qui dans d'autres organismes, contribue à la liaison du kinétochore à I'ADN et aux microtubules du fuseau. En utilisant les outils que j'ai générés, j'ai pu montrer que B. mori CENP-T est essentiel à la progression mitotique et à la fois nécessaire et suffisant pour recruter les composants interagissants avec le fuseau. Pris ensemble, les résultats de mon projet de doctorat généreront un nouveau système modèle pour l'étude de l'assemblage des kinétochores indépendants de CenH3. |
