| Přispěvatelé: |
University of Helsinki, Faculty of Pharmacy, Doctoral Programme in Materials Research and Nanoscience, Helsingin yliopisto, farmasian tiedekunta, Materiaalitutkimuksen ja nanotieteiden tohtoriohjelma, Helsingfors universitet, farmaceutiska fakulteten, Doktorandprogrammet i materialforskning och nanovetenskap, Kallio, Pasi, Sikanen, Tiina, Haapala, Markus |
| Popis: |
Drug metabolism is a detoxification process by which the body converts pharmaceuticals into more hydrophilic metabolites. Understanding of the drug metabolism process and metabolic profiling plays a vital role in drug development processes by ensuring the safety and efficacy of treatments. Cytochromes P450 (CYP) are a superfamily of enzymes that are primarily responsible for metabolizing the majority of clinically relevant drugs. In preclinical drug development research, there is a constant need for the identification of metabolites and their CYP isoenzyme-specific elimination route, as well as possible drug-drug interactions thereof using high speed in vitro techniques. Miniaturization of the drug metabolism assays and related processes could further improve the throughput via parallelism and integration of several analytical steps on a single platform, as well as reducing the consumption of expensive reagents substantially. Micro total analysis systems (µTAS) usually refer to microfabricated devices that integrate several analytical unit operations, such as sample preparation, extraction, separation, and analysis on a single platform. These µTAS platforms can be either continuous-flow microchannel based systems or discrete droplet systems. Digital microfluidics (DMF) is one such technology, where sample droplets are manipulated individually on an array of electrodes. In DMF, the droplets of hundreds of nanolitres to a few microliters of volume can be dispensed, split, mixed, and merged independently via programmed and automated voltage application. In this thesis, several DMF-based bioanalytical concepts were developed and their feasibility for implementing droplet-scale drug metabolism assays was evaluated. In the first sub-project, droplet-scale immobilized enzyme reactors were developed by immobilizing CYP enzymes on porous polymer monoliths affixed onto a DMF platform. Assay incubation at physiological temperature was facilitated by localized heating of the DMF platform using integrated inkjet-printed microheaters. For the on-chip detection of drug metabolites, a protocol facilitating interfacing of the DMF device with a commercial wellplate reader was developed. In the second sub-project, the developed DMF platform, featuring the CYP reactors, were interfaced with ambient mass spectrometry (MS) via desorption atmospheric pressure photoionization (DAPPI). For in situ identification of the drug metabolites by DAPPI-MS, the chip design was optimized to be able to control the critical surface sensitive processes, such as sample precipitation and subsequent desorption/ionization directly from DMF surfaces. In addition, the feasibility of the same platform for a droplet-based liquid-liquid extraction of pharmaceuticals was demonstrated. All pharmaceuticals and metabolites analyzed could be detected with lower limits of detection in the range of a few picomoles. In the third sub-project, DMF droplet manipulation was interfaced with channel microfluidics to facilitate more versatile sample preparation such as separation of target analytes after the droplet-based enzyme reactions and prior to detection. To support the scaling up of the developed technology toward mass manufacturing, the entire device was assembled using low-cost inkjet printing and non-cleanroom polymer processing techniques. To achieve this interfacing, off-stoichiometric thiol-ene (OSTE) polymers were introduced as a new alternative dielectric material for the coating of inkjet-printed DMF electrode arrays, as well as for the integration of the microchannels with a DMF platform. In the fourth sub-project, magnetic bead based enzyme immobilization protocol was developed to facilitate screening the individual variation of CYP activities in donor-derived human liver microsomes (HLM) in droplet-scale. A CYP1A isoenzyme-specific model reaction was chosen to assess the inter-individual variation in the activities of this metabolic route in the liver microsomes collected from five individuals. The demonstrated protocol was shown to be technically feasible for biopsy-scale samples. In all, the new droplet-scale concepts developed in this thesis are first-in-their-kind examples of droplet-scale drug metabolism assays on DMF platform. The methods developed are generally qualitative or semi-quantitative and thus, in their present form, best feasible for the preliminary determination of metabolic clearance via CYP or identification of the produced metabolites of new drug candidates in vitro. Further development of the technology, particularly the enzyme immobilization process and the quantification of the produced metabolites, is needed to improve the wider applicability of the assays. It is noteworthy however that all of the fabrication processes and interfacing approaches taken in this thesis were carried out in regular, non-cleanroom laboratory conditions, which is foreseen to significantly improve the adaptability of the technology in any bioanalytical laboratories. Lääkeainemetabolia on elimistön suojamekanismi, joka muuntaa yleensä hyvin rasvaliukoiset lääkeaineet entsymaattisesti vesiliukoisemmiksi metaboliiteiksi. Lääkeainemetabolialla on siksi keskeinen rooli lääkkeenkehityksessä lääkehoidon tehon ja turvallisuuden varmistamiseksi. Valtaosa kliinisessä käytössä olevista lääkeaineista metaboloituu sytokromi P450 (CYP) –entsyymien kautta. Yksi prekliinisen lääkekehityksen tärkeimpiä tehtäviä on tunnistaa lääkeaineiden metaboliitit ja niiden CYP-isoentsyymikohtaiset eliminaatioreitit sekä ennakoida mahdollisia lääkkeiden haitallisia yhteisvaikutuksia nopeiden in vitro –tekniikoiden avulla. Lääkeainemetaboliatutkimuksessa käytettävien menetelmien miniatyrisointi mahdollistaa paralleelien ja toisiinsa integroitujen analyysiyksiköiden valmistamisen, mikä tehostaa lääkkeiden seulontaa sekä vähentäisi kalliiden reagenssien kulutusta. TAS-konsepti (engl. Micro total analysis systems) viittaa mikrovalmistusmenetelmillä tuotettuihin analyysilaitteisiin, joissa samalle alustalle on integroitu useita analyyttisiä yksikköoperaatioita kuten näytteenkäsittely, uutto, erotus ja havainnointi. µTAS-laitteet voivat olla esimerkiksi mikrokanavia sisältäviä jatkuvan virtauksen laitteita tai yksittäisten pisaroiden liikuttelun mahdollistavia laitteita. Digitaalimikrofluidistiikka (engl. digital microfluidics, DMF) on eräs tekniikka, joka mahdollistaa pisaroiden kontrolloidun käsittelyn sähköelektrodien päällä. DMF:ssa pisarat ovat tilavuudeltaan satoja nanolitroja – muutama mikrolitra ja niitä voidaan syöttää, jakaa, sekoittaa ja yhdistää yksitellen käyttäen ohjelmoitavaa ja automaattista jännitteen syöttöä. Tässä väitöskirjassa kehitettiin useita DMF:aan perustuvia bioanalyyttisia sovelluksia tavoitteena selvittää DMF-teknologian soveltuvuutta lääkeainemetaboliatutkimukseen pisaramittakaavassa. Ensimmäisessä osajulkaisussa kehitettiin pisarakokoluokan entsyymireaktori kiinnittämällä CYP-entsyymejä huokoiseen polymeerimonoliittiin, joka oli kiinnitetty DMF-alustaan. Entsyymireaktorin lämmittämiseksi fysiologiseen lämpötilaan kehitettiin mustesuihkutulostettu lämmitinelementti, joka kiinnitettiin DMF-alustaan. Metaboliittien havainnoimiseksi kehitettiin menetelmä, joka mahdollisti DMF-mikrosirun yhdistämisen kaupalliseen kuoppalevylukijaan. Toisessa osajulkaisussa DMF-pohjaisia CYP-entsyymireaktorit liitettiin massaspektrometriaan hyödyntämällä desorptio/fotoionisaatiota ilmanpaineessa (engl. desoprtion atmospheric pressure photoionization, DAPPI). Jotta lääkeainemetaboliitit voitiin tunnistaa massaspektrometrisesti suoraan DMF-alustalta, mikrosiru optimoitiin siten, että näytteen haihtumista ja desoprtio/ionisaatio-prosessia pystyttiin kontrolloimaan pinnan ominaisuuksien avulla. Kehitetyn DMF-alustan soveltuvuus osoitettiin myös lääkeaineiden pisarapohjaisessa neste-neste-uutossa. Kaikkien lääkeaineiden ja metaboliittien havaintoalarajat olivat pikomolaarisella tasolla. Kolmannessa osajulkaisussa pisaroiden käsittelyyn kehitetty DMF-alusta yhdistettiin mikrokanavarakenteisiin, mikä mahdollistaa monipuolisemman näytteenkäsittelyn kuten reaktiotuotteiden erotuksen ennen havainnointia. Tässä osajulkaisussa käytettiin edullisia, massatuotantoon skaalautuvia valmistusmenetelmiä, kuten mustesuihkutulostusta ja polymeeriprosessointia. DMF-alustan ja mikrokanavien yhdistämiseksi osajulkaisussa tutkittiin uuden, epästoikiometrisen tioleenipolymeerin soveltuvuutta DMF-teknologiaan sekä dielektrisenä kerroksena että mikrokanavien valmistusmateriaalina. Neljännessä osajulkaisussa kehitettiin magneettipartikkelipohjainen entsyymi-immobilisointimenetelmä, joka mahdollisti luovuttajakohtaisten maksamikrosomien käytön pisarakokoluokan CYP-aktiivisuusmäärityksissä. DMF-alustan soveltuvuutta yksilöllisten erojen selvittämiseen tutkittiin CYP1A-entsyymille spesifisen mallireaktion avulla viiden eri luovuttajan maksamikrosomeilla. Menetelmän todettiin teknisten ominaisuuksiensa puolesta soveltuvan CYP-aktiivisuuden määrittämiseen jopa biopsianäytteistä. Kokonaisuudessaan tässä väitöskirjassa kehitetyt pisarapohjaiset, bioanalyyttiset menetelmät ovat ensimmäisiä DMF-teknologian sovelluksia lääkeainemetaboliatutkimuksessa. Kaikki kehitetyt menetelmät ovat joko kvalitatiivisia tai semikvantatiivisia ja soveltuvat siten nykyisessä muodossaan lähinnä alustaviin lääkeaineen metaboliareittiä selvittäviin tutkimuksiin tai uusien lääkeainekandidaattien metaboliittien nopeaan tunnistamiseen in vitro. Tekniikan jatkokehitys, erityisesti entsyymien immobilisoinnin sekä metaboliittien kvantitoinnin osalta, on kuitenkin tarpeellista menetelmien laajemman käytettävyyden parantamiseksi. Huomionarvoista kuitenkin on, että kaikki tässä työssä käytetyt valmistusmenetelmät soveltuvat normaaleihin laboratorio-olosuhteisiin, myös puhdastilojen ulkopuolelle, mikä mahdollistaa kehitettyjen tekniikoiden soveltamisen missä tahansa bioanalytiikan laboratoriossa. |
