Florotaninos da alga Fucus vesiculosus: extração, caracterização estrutural e efeitos ao longo do trato gastrointestinal
| Autor: | Catarino, Marcelo Dias |
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| Přispěvatelé: | Cardoso, Susana Maria de Almeida, Silva, Artur M. S., Mateus, Nuno Filipe da Cruz Baptista |
| Jazyk: | angličtina |
| Rok vydání: | 2021 |
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| Zdroj: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) instacron:RCAAP |
| Popis: | Marine macroalgae have a long tradition of usage and applications among the far Eastern populations, either for direct consumption and nutrition or for medicinal purposes. During the recent years, these marine organisms have received increasing popularity among the Western populations which are becoming aware of their potential to be exploited as a source of valuable bioactive compounds. Among these compounds are the phlorotannins, which are a group of phloroglucinol-derived phenolic compounds occurring exclusively on brown seaweeds and claimed for their promising health-promoting effects. Although several bioactive properties have been demonstrated for these compounds, there is still a long way to go before understanding the mechanisms behind them, and this is particularly true for the anti-inflammatory and antitumor properties of phlorotannins from Fucus vesiculosus. Moreover, little is known about the fate of these compounds when crossing the gastrointestinal tract. In this context, the aim of this work was to maximize the extraction of phlorotannins from this species for further characterization through UHPLC DAD-ESI-MSn analysis and evaluation of the bioactive properties that could be relevant from a performance point of view throughout the gastrointestinal tract, namely antioxidant, anti-inflammatory, antitumor and prebiotic effects. Through the response-surface methodology, the conditions determined for maximum recovery of F. vesiculosus phlorotannins were acetone 67% (v/v) in a proportion of 70 mL/g of seaweed powder at 25 °C. After an intermediate purification step, the phlorotannin-rich fraction (EtOAc) revealed a complex chromatographic profile composed of several fucols, fucophlorethols, fuhalols and several other phlorotannin derivatives. Additionally, three potential new phlorotannin derivatives, namely fucofurodiphlorethol, fucofurotriphlorethol and fucofuropentaphlorethol have been tentatively identified in this extract. Both the crude extract and EtOAc revealed good antioxidant activity, particularly against the nitric oxide radical, which is as very important player in the inflammatory signalling cascade. Indeed, strong anti-inflammatory activity was confirmed in a cellular system of inflammation using lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 cells. From the EtOAc further subfractions with phlorotannins of increasing molecular weights were obtained and tested in the same cell line, revealing some differences between their anti-inflammatory activity which could be related to their complexity and molecular weight. A remarkably strong anti-inflammatory activity was observed for a particular subfraction, F2, characterized by the presence of a major phlorotannin derivative with molecular weight of 508 g/mol. At 200 µg/mL this subfraction was capable of inhibiting IκBα phosphorylation and degradation, and consequently blocking the pro-inflammatory signalling cascade at the transcriptional level. The EtOAc and some of its subfractions, namely F1 and F5, also demonstrated promising antitumor properties exerting a selective cytotoxic effect against gastric (MKN-28) and colon cancer cells (Caco 2 and HT-29) but not on normal cells. From these samples, F5, characterized for the presence of fucols, fucophlorethols, a fucofurodiphlorethol and eckstolonol, revealed the strongest effect in all the three tumor cell lines, exhibiting IC50 values of 56.3 ± 14.7, 97.4 ± 11.6 and 118.8 ± 19.7 µg/mL for MKN-28, Caco-2 and HT 29, respectively. Interestingly, while the EtOAc displayed this activity via induction of cell cycle arrest and activation of cell death mechanisms, the subfraction F1 only caused cell cycle arrest and the subfraction F5 only triggered cell death via activation of the apoptotic/necrotic mechanisms. Finally, these compounds were found to exert promising inhibitory capacity against some digestive enzymes, particularly α-glucosidase, in which the IC50 values were 45 a 250 times lower compared to acarbose, thus revealing a therapeutical potential for the treatment of type-II diabetes. However, similar to plant polyphenols, phlorotannins were found to be susceptible to degradation and loss of antioxidant activity during their passage through the gastrointestinal tract, with less than 15% of the initial total phlorotannins becoming bioaccessible and available for absorption. In turn, although the non-bioaccessible fraction of F. vesiculosus samples only contributed with a modest positive effect for the modulation of human microbiota, they could stimulate the production of propionate and butyrate,’pç which are two short-chain fatty acids with well established health-promoting properties for the host. In conclusion, this study not only allowed better understanding of the phlorotannin composition of F. vesiculosus, but also demonstrates that its extracts and/or purified fractions may have a relevant impact in the maintenance of a positive gastrointestinal health acting at different levels. Ultimately, this work contributes to the valorization of this species as a possible supply of natural compounds with great bioactive potential and applicability. Desde a antiguidade que as macroalgas marinhas têm sido tradicionalmente usadas pelos povos de extremo oriente, quer para consumo direto, como fonte de nutrientes, como para fins medicinais. Nos últimos anos estes organismos marinhos têm vindo a ganhar uma crescente popularidade entre as populações ocidentais que começam a estar cada vez mais conscientes do potencial que estas possuem como uma possível fonte de compostos bioativos de grande interesse. De entre os seus compostos destacam-se os florotaninos, um grupo de compostos fenólicos derivados do floroglucinol, reivindicados pelos seus benefícios para a saúde, e cuja ocorrência é exclusiva das macroalgas castanhas. Apesar de várias propriedades bioativas terem já sido demonstradas para estes compostos, existe ainda um longo percurso a percorrer até à compreensão dos mecanismos por detrás destas, sendo isto particularmente verdade no que diz respeito às propriedades anti-inflamatórias e antitumorais dos florotaninos provenientes da macroalga Fucus vesiculosus. Além disso, pouco se sabe acerca do destino destes compostos durante a sua passagem pelo trato gastrointestinal. Neste contexto, neste trabalho pretendeu-se otimizar a extração de florotaninos a partir desta macroalga e elucidar a composição destes extratos através da técnica de UHPLC-DAD-ESI-MSn , bem como clarificar as potencialidades bioativas de extrato bruto ou frações do ponto de vista de atuação ao longo to trato gastrointestinal, nomeadamente os efeitos antioxidante, anti-inflamatório, antitumoral e prébiotico. Recorrendo à técnica de superfície-resposta, as condições determinadas para o máximo de recuperação de florotaninos da alga F. vesiculosus foram: acetona a 67% (v/v) numa proporção de 70 mL/g de farinha de alga a 25 ºC. Após um passo de purificação intermédio, a fração rica em florotaninos (EtOAc) revelou um complexo perfil cromatográfico composto por vários fucóis, fucofloretóis, fualóis e outros derivados de florotaninos. Foram ainda detetados três potenciais novos derivados de florotaninos, nomeadamente o fucofurodifloretol, fucofurotrifloretol e o fucofuropentafloretol. Tanto o extrato bruto como a EtOAc revelaram boa atividade antioxidante, em particular contra o radical de óxido nítrico, um importante interveniente na cascata sinalizadora da inflamação. De facto, uma atividade anti-inflamatória pronunciada foi confirmada em células RAW 264.7 estimuladas com lipopolissacarídeo (LPS). A partir da EtOAc foram ainda obtidas 9 sub-frações de florotaninos com diferentes pesos moleculares que, após testadas na mesma linha celular, revelaram algumas diferenças ao nível da atividade anti inflamatória que possivelmente estarão relacionados com a sua complexidade e peso molecular. Um efeito anti-inflamatório bastante marcado foi ainda observado para uma sub-fração em particular, a F2, caracterizada pela presença de um composto derivado de florotaninos com peso molecular de 508 g/mol. Esta fração, a 200 µg/mL, foi capaz de inibir a fosforilação e degradação da proteína IκBα, consequentemente bloqueando a cascata sinalizadora da inflamação ao nível transcricional. A fração EtOAc bem como algumas das posteriores sub-frações, nomeadamente F1 e F5, demostraram ainda propriedades antitumorias promissoras, provocando um efeito citotóxico seletivo apenas contra células tumorais de cancro gástrico (MKN-28) e cancro do colon (Caco-2 e HT-29), não afetando células normais. Das três amostras, a F5, caracterizada pela presença de fucóis, fucofloretóis, um fucofurodifloretol e eckstolonol, foi a que revelou o efeito mais acentuado em todas as linhas celulares tumorais, demonstrando valores de IC50 de 56.3 ± 14.7, 97.4 ± 11.6 e 118.8 ± 19.7 µg/mL para MKN-28, Caco-2 e HT-29, respetivamente. Curiosamente, enquanto a EtOAc exerceu este efeito através do bloqueio do ciclo celular e ativação de mecanismos de morte celular, a sub-fração F1 apenas promoveu o bloqueio do ciclo celular enquanto a sub-fração F5 apenas ativou a morte celular via ativação de mecanismos de apoptose/necrose. Por fim, verificou-se uma boa capacidade inibidora das enzimas digestivas por parte destes compostos, em particular da enzima α-glucosidase cujo IC50 foi 45 a 250 vezes inferior ao da acarbose, revelando potencial terapêutico contra a diabetes do tipo-II. No entanto, à semelhança dos polifenóis das plantas, os florotaninos revelaram-se suscetíveis a degradação e perda de atividade antioxidante durante a sua passagem ao pelo trato gastrointestinal, com menos de 15% dos florotaninos totais da amostra inicial ficando bioacessíveis e disponíveis para absorção. Em contrapartida, apesar de a fração não bioacessível das amostras de F. vesiculosus terem apenas contribuído com um efeito modestamente positivo na modulação da microbiota humana, estas demonstraram uma capacidade interessante de estimular a produção de propionato e butirato, dois ácidos gordos de cadeia curta com propriedades benéficas para a saúde do hospedeiro bem estabelecidas. Em conclusão, este estudo não só permitiu compreender melhor a composição dos florotaninos presentes na alga F. vesiculosus, como também demonstrou que os seus extratos e/ou frações purificadas podem ter um impacto relevante na manutenção de uma boa saúde gastrointestinal atuando em diferentes níveis. Em última instância, este trabalho contribui para a valorização da espécie F. vesiculosus como uma possível fonte de compostos naturais com grande potencial biológico e de aplicabilidade. Programa Doutoral em Química Sustentável |
| Databáze: | OpenAIRE |
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