Separación y caracterización de glicopéptidos y glicanos en fluidos biológicos. Aplicación al diagnóstico del cáncer y otras patologías

Autor: Mancera Arteu, Montserrat
Přispěvatelé: Sanz Nebot, María Victoria, Giménez López, Estela, Universitat de Barcelona. Departament d'Enginyeria Química i Química Analítica
Jazyk: Spanish; Castilian
Rok vydání: 2020
Předmět:
Zdroj: Dipòsit Digital de la UB
Universidad de Barcelona
TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)
TDR. Tesis Doctorales en Red
Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)
Popis: [spa] La presente tesis doctoral se centra en el desarrollo de nuevos métodos de análisis para la identificación y separación de glicopéptidos y glicanos utilizando técnicas microseparativas acopladas a la espectrometría de masas (cromatografía de líquidos capilar y electroforesis capilar, CapLC-MS y CE-MS). Aunque el análisis de los glicopéptidos es una estrategia habitualmente utilizada para la caracterización de productor farmacéuticos, continúa siendo difícil la detección de glicoformas poco abundantes que podrían ser esenciales para diferenciar proteínas endógenas de variantes recombinantes. De este modo, en esta tesis se han desarrollado dos métodos para la purificación selectiva de glicopéptidos, obtenidos de digestos de glicoproteínas, utilizando la eritropoetina humana recombinante (rhEPO) como glicoproteína modelo. Por otro lado, en muchas patologías se han descrito alteraciones en los glicanos de ciertas glicoproteínas en presencia de procesos inflamatorios importantes y muchos tipos de cáncer. Además, dado que ciertas estructuras de glicano así como tipos de enlace han estado relacionados con enfermedades específicas, la caracterización exhaustiva de los tipos de enlace de los isómeros de los glicanos ha suscitado gran interés biomédico en los últimos años. En este sentido, se han establecido en esta tesis doctoral diferentes metodologías para la caracterización de los isómeros de los glicanos de la alfa-1-glicoproteína ácida (hAGP), la cual ha generado interés biomédico dada la alteración de sus glicanos en ciertos procesos inflamatorios y cáncer. Primero, la digestión con diversas exoglicosidasas (sialidasa, fucosidasa y galactosidasa) en combinación con el análisis de los glicanos per cromatografía de líquidos capilar de interacción hidrofílica zwitteriónica acoplada a la espectrometría de masas (CapZIC-HILIC-MS) y la estrategia GRIL utilizando [12C6]/[13C6]- anilina, permitió asignar los enlaces de los ácidos siálicos, así como de las fucosas de los isómeros de los glicanos de la hAGP. Por otro lado, se desarrolló un método para asignar los isómeros de los glicanos per espectrometría de masas en tándem de alta resolución. La posibilidad de separar los isómeros antes de la detección, juntamente con la obtención de la masa exacta de los iones fragmentos, permitió el establecimiento de un método de caracterización de los glicanos fiable por CapZIC-HILIC-MS/MS. Además, la doctoranda realizó una estancia en la Freie Universität Berlin (Berlin, Alemania), bajo la supervisión del Dr. Kevin Pagel, para estudiar la separación de los isómeros de glicanos per espectrometría de movilidad iónica acoplada a la espectrometría de masas (IM-MS). Finalmente, el método por CapZIC-HILIC-MS en combinación con la estrategia GRIL utilizando [12C6]/[13C6]-anilina se aplicó en esta tesis para el análisis de muestras patológicas, con el fin de evaluar posibles alteraciones en los isómeros de los glicanos de dos glicoproteínas de fase aguda, l’hAGP y la transferrina de ratón (mTf), en presencia de ciertos procesos inflamatorios y cáncer. Además, se emplearon herramientas quimiométricas con el objetivo de identificar glicanos como candidatos biomarcadores de estas patologías.
[eng] The present thesis is focused on the development of novel analytical methods for the identification and separation of glycopeptides and glycans by microseparative techniques coupled to mass spectrometry. Although the analysis of glycopeptides is a commonly used strategy for glycan characterization of biopharmaceuticals, the detection of low abundant glycopeptides that could be essential to differentiate endogenous and recombinant variants of certain proteins continues to be a challenge. In this thesis, methods to selectively enrich glycopeptides from glycoprotein digests were developed using recombinant human erythropoietin (rhEPO) as model glycoprotein. On the other hand, alterations in glycan structures have been described in presence of important inflammatory processes and many types of cancer. As certain glycan isomers or linkage-types have been related to specific pathologies, the in depth characterization of glycan isomer linkage-types has aroused great interest in last years. In this regard, different methodologies were established in this thesis to characterize human alpha-1-acid glycoprotein (hAGP) glycan isomers, whose glycosylation has been described to be altered in several diseases. Exoglycosidase digestions, tandem mass spectrometry (MS/MS) as well as ion-mobility mass spectrometry (IM-MS) were used with this purpose. Finally, the established method for glycan isomer separation in combination with the GRIL strategy with [12C6]/[13C6]aniline was used in this thesis to evaluate possible glycan isomer modifications in two acute-phase proteins, hAGP and mouse transferrin (mTf), caused by certain inflammatory diseases and cancer. Moreover, multivariate data tools, such as PCA and PLS-DA, were also employed in these studies to identify glycan-based biomarker candidates.
Databáze: OpenAIRE
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