Expression and purification of the plasmodial lactate transporter (PfFNT) for structure elucidation
| Autor: | Hajek, Philipp Georg |
|---|---|
| Přispěvatelé: | Beitz, Eric, Scheidig, Axel, Prof. Dr. Eric Beitz, Prof. Dr. Axel Scheidig |
| Jazyk: | němčina |
| Rok vydání: | 2019 |
| Předmět: |
Abschlussarbeit
purification structure elucidation PfFNT PfFNT Reinigung Pichia pastoris Strukturaufklärung Faculty of Mathematics and Natural Sciences doctoral thesis Strukturaufklärung Pichia pastoris PfFNT purification Pichia pastoris structure elucidation ddc:500 ddc:5XX Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät Reinigung |
| Popis: | Mit der Entdeckung und Charakterisierung des plasmodialen Laktattransporters (PfFNT) wurde kürzlich ein valides, neues Wirkstofftarget zur Therapie der Malaria identifiziert. PfFNT wurde im Rahmen dieser Arbeit mit Pichia pastoris in einem eukaryotischen Expressionsystem im 2-Liter-Fermentermaßstab hergestellt, um große Mengen Protein für die Strukturaufklärung durch Röntgenkristallographie zu gewinnen. Dabei sollte der Einfluss von Detergenzien auf Reinigung, Stabilität und Kristallisation des Proteins untersucht werden. Mit P. pastoris-Zellen konnten erfolgreich mehrere Milligramm PfFNT hergestellt und durch Nickelaffinitätschromatographie und Größenausschlusschromatographie gereinigt werden. Zur Solubilisierung von PfFNT aus den Lipidmembranen der P. pastoris-Zellen waren DDM und LDAO die geeignetesten Detergenzien. Mit LDAO konnten dabei deutlich größere Ausbeuten erzielt werden. Während der Nickelaffinitätschromatographie wurde das Solubilisierungsdetergens zur Stabilisierung gegen DM, DDM, β-OG und FC 12 ausgetauscht. Durch weitere Reinigung per Größenausschlusschromatographie wurde PfFNT mit allen getesteten Stabilisierungsdetergenzien inklusive LDAO im nativen Oligomersierungszustand eines Pentamers isoliert, wie transmissions-elektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigt haben. Das hergestellte Protein war funktionell, wie die Untersuchungen in Proteoliposomen in einer stopped-flow-Apparatur bestätigt haben. Des Weiteren wurde die Langzeitbindung eines PfFNT-Inhibitors über 24 h gezeigt. Mit initialen Kristallisationsscreenings konnten erste Kristallisationsbedingungen mit allen vorher genannten Stabilisierungsdetergenzien ermittelt werden. Das beschriebene Protokoll für die Produktion von PfFNT in P. Pastoris-Zellen und die anschließende Reinigung liefert funktionelles und hoch gereinigtes Protein und stellt mit den daraus initial ermittelten Kristallisationsbedingungen eine hervorragende Grundlage für die zukünftige Aufklärung der Proteinstruktur dar. With the discovery and characterization of the plasmodial lactate transporter (PfFNT) a valid new drug target was recently identified for the treatment of malaria. In this work, PfFNT was produced in an eukaryotic expression system using Pichia pastoris at a two-liter fermenter scale to obtain large amounts of protein for structure elucidation by Xray crystallography. In particular, the influence of detergents on the purification, stability and crystallization of the protein was investigated. With P. pastoris cells, several milligrams of PfFNT could be successfully produced and purified by nickel-affinity-chromatography and size exclusion chromatography. DDM and LDAO were the most suitable detergents for solubilisation from lipid membranes of P. pastoris cells. With LDAO, significantly higher yields could be achieved. During nickel-affinity-chromatography, solubilization detergents were changed for stabilization with DM, DDM, β-OG and FC 12. By further purification using size exclusion chromatography, PfFNT was isolated with all tested stabilization detergents including LDAO in the native oligomerization state of a pentamer, as confirmed by transmission electron microscopi. The produced protein was functional, as investigations in proteoliposomes in a stopped-flow apparatus confirmed. Furthermore, the long-term binding of a PfFNT inhibitor over 24 hours was shown. Initial crystallisation screenings revealed first crystallization conditions with all previously mentioned stabilization detergents. The protocol described in this thesis for production of PfFNT in P. Pastoris cells and the subsequent purification provides functional and highly purified protein. Together with initially determined crystallization conditions it represents an excellent basis for future elucidation of the protein structure. |
| Databáze: | OpenAIRE |
| Externí odkaz: |
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