Nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN) com a sistema d’elecció per a transfecció cel·lular de DNA/RNA

Autor: Fábregas, A. (Anna)
Přispěvatelé: Miñarro Carmona, Montserrat, Suñé i Negre, Carles Maria, Suñé i Negre, Carles, Universitat de Barcelona. Departament de Farmàcia i Tecnologia Farmacèutica
Rok vydání: 2015
Předmět:
Zdroj: Dipòsit Digital de la UB
Universidad de Barcelona
TDX (Tesis Doctorals en Xarxa)
TDR. Tesis Doctorales en Red
instname
Popis: Davant la necessitat de nous enfocaments en el tractament de determinades malalties, en els darrers anys s’han desenvolupant sistemes nanoestructurats no virals com a vehiculitzadors d’agents terapèutics -entre els que es troben els àcids nucleics- com a alternativa tant a les formes farmacèutiques clàssiques com als sistemes virals, els quals presenten riscos associats que no compensen els eventuals beneficis. Entre els diversos tipus de sistemes no virals per a transfecció d’àcids nucleics (DNA i RNA) dirigits a la regulació de l’expressió gènica, es troben les nanopartícules polimèriques catiòniques de quitosan-TPP i les nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN). El diàmetre mitjà de les nanopartícules i el potencial superficial obtingut (entès com a potencial Z) són variables clau per determinar la seva idoneïtat per a l’ús previst. Les nanopartícules polimèriques catiòniques de quitosan-TPP s’obtenen majoritàriament pel mètode de gelificació ionotròpica. En aquest treball, s’han optimitzat certs paràmetres operacionals del mètode per tal de reduir el temps de síntesi i aconseguir nanopartícules de mida i potencial Z adients. Enfront la variabilitat que presenta aquesta classe de sistema nanoparticulat, i molt particularment a causa de la puresa i grau de desacetilació de la matèria primera, es proposa l’estudi d’un sistema alternatiu per a transfecció d’àcids nucleics. Aquest sistema d’elecció són les nanopartícules lipídiques sòlides catiòniques (cSLN), obtingudes pel mètode la microemulsificació en calent. A partir d’una formulació original, i per tal de reduir al màxim els components de la formulació i per tant, els riscos de citotoxicitat, s’avaluen diferents components i la quantitat mínima necessària a la formulació, sense comprometre ni la mida de partícula ni el potencial Z. La caracterització dels components i les seves interaccions, així com la determinació de les propietats de la formulació resultant per mitjà de diverses tècniques instrumentals, indiquen la idoneïtat de les cSLN per a l’ús previst. Els estudis de citotoxicitat en les línies cel·lulars HEK293T i HeLa demostren que la viabilitat cel·lular no es veu compromesa per la presència de cSLN en determinades quantitats. A partir de plasmidis d’expressió eucariota, es determina per mitjà d’assajos de retardament en gel la relació òptima cSLN:pDNA per a un 100% d’eficiència d’unió. A partir d’aquesta dada, es porten a terme estudis d’expressió funcional d’un fragment del gen que codifica per al factor de transcripció TCERG1 per mitjà d’immunoblotting, i del gen Luc que codifica per a l’enzim luciferasa per mitjà d’un assaig de bioluminescència, que demostren l’expressió proteica a partir de la transfecció de lipoplexos cSLN:pDNA. Així mateix, i a partir d’un fragment de siRNA contra TCERG1, s’estableix la relació òptima cSLN:siRNA per a un 100% d’eficiència d’unió. En aquest cas, l’estudi es complementa amb l’avaluació de l’eficiència de transfecció dels lipoplexos cSLN:siRNA. Es pot concloure que el siRNA és capaç d’arribar a la cèl·lula quan s’utilitzen cSLN com a agent de transfecció, obrint la porta a la possibilitat de regulació de l’expressió gènica a partir de lipoplexos cSLN:siRNA.
Nanostructured non-viral delivery systems have recently being developed for transfection of therapeutic agents such as nucleic acids. Cationic polymeric nanoparticles of chitosan-TPP and cationic solid lipid nanoparticles (cSLN) are two of these delivery systems. In this work, several key operational parameters linked to the ionotropic gelation method were optimized to develop cationic polymeric chitosan-TPP nanoparticles. Because of the variability of the methodology and the raw material in the properties of nanoparticles, cationic solid lipid nanoparticles (cSLN) were chosen as an alternative system for delivery of various nucleic acids such as plasmid DNA. To this goal, the first specific aim was to decrease the components of a starting formulation to minimize the risk of cell toxicity. The components of the formulation were qualitatively and quantitatively assessed to achieve the minimum amount necessary for obtaining cSLN, while maintaining a proper particle size and Z potential. The suitability of the cSLN was studied through the characterization of the components, their interactions, and the properties of the resulting formulation. The optimal ratio for cSLN:pDNA lipoplexes was determined by using gel retardation assays, with an achievement of 100% binding efficiency. Minimal toxicity of the cSLN was observed in cell cultures using the established HEK293T and HeLa cell lines. More importantly, the cSLN were able to transiently express proteins from transfected DNA, which were detected by using bioluminescence assays. In addition, the optimal ratio for cSLN:siRNA (a 21-oligonucleotide targeting a transcription factor) was established to achieve 100% binding efficiency. The transfection efficiency of the cSLN:siRNA lipoplexes was confirmed in HEK293T and HeLa cells. The results demonstrate the efficacy of the developed cSLN-based lipoplexes for delivery of nucleic acids to regulate gene expression.
Databáze: OpenAIRE
Externí odkaz: