Caracterización patogénica y molecular de Tritrichomonas foetus aisladas de rodeos bovinos

Autor: Doumecq, María Laura
Přispěvatelé: Soto, Pedro, Monteavaro, Cristina Esther
Jazyk: Spanish; Castilian
Rok vydání: 2021
Předmět:
Zdroj: RIDAA (UNICEN)
Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires
instacron:UNICEN
Popis: La trichomonosis bovina (TB) es una enfermedad de transmisión sexual causada por el protozoario Tritrichomonas foetus que afecta la productividad de los rodeos, especialmente de cría, al provocar muerte embrionaria, piómetra y abortos esporádicos. En la presente tesis se plantearon dos objetivos generales: caracterizar el perfil patogénico y el perfil molecular de T. foetus aisladas demuestras clínicas de bovinos pertenecientes a diferentes establecimientos agropecuarios de la provincia de Buenos Aires. Para el estudio se constituyó un cepario con 114 aislamientos crio preservados de T. foetus de bovinos. Los aislamientos fueron derivados de diferentes laboratorios de la provincia de Buenos Aires. Del cepario constituido, se seleccionaron 26 aislamientos de diferentes regiones ganaderas de la provincia de Buenos Aires. Los aislamientos seleccionados fueron clonados para estudiarlos como clones o cepas, y confirmados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La puesta a punto de la técnica de clonado nos permitió obtener cepas a partir de primo cultivos y caracterizarlas colonias en medios sólidos observando que todas las cepas en estudio producían la hemólisis de glóbulos rojos bovinos. Los perfiles patogénicos de las cepas de T. foetusse caracterizaron por evaluación de la actividad hemolítica, la producción de absceso subcutáneo en ratones BALB/c, la citoadherencia sobre células vaginales de ratón y células CHO, el efecto citopatogénico (ECP) sobre células CHO y la persistencia de la infección vaginal de ratonas BALB/c. Los resultados de la actividad hemolítica, la citoadherencia y el ECP en línea celular CHO, permitieron categorizar las cepas de T. foetus. La instalación de la infección vaginal en el modelo ratón y la evaluación de su persistencia durante 5 semanas, permitió observar lesiones en el tracto reproductor con persistencia prolongada. Los perfiles moleculares se caracterizaron por determinación del perfil de carbohidratos mediante lectinocito química, determinación del perfil proteico en SDS-PAGE, determinación de la presencia del gen de lacisteín-proteasa 8 (CP8) mediante PCR y utilización de marcadores moleculares para determinar polimorfismo genético entre las cepas. Por SDS-PAGE se observaron perfiles proteicos homogéneos. La presencia del gen de la CP8 se confirmó en la totalidad de las cepas. La posterior secuenciación permitió comprobar la ausencia de polimorfismo tanto en el gen como en su región promotora. La lectinocito química determinó un predominio en las cepas estudiadas de manosa, N-acetil glucosamina y ácido siálico. Los resultados de la caracterización patogénica y molecular presentaron variabilidad entre las cepas de T. foetus estudiadas, sin embargo los marcadores moleculares permitieron identificar dos genotipos definiendo un patrón patogénico vinculado al ECP y la actividad hemolítica. El genotipo BL, al cual pertenecen 21/26 cepas, presentaron marcado ECP y alta actividad hemolítica. El genotipo minoritario B, 5/26 se corresponde con cepas con leve ECP sobre la línea celular CHO y actividad hemolítica baja. Por lo tanto, teniendo en cuenta todos estos resultados, podemos concluir que las cepas de T. foetus obtenidas a partir de muestras clínicas presentan diferencias en las variables en estudio vinculadas con la patogenicidad. Bovine trichomonosis (BT) is a sexually transmitted disease caused by the protozoan Tritrichomonas foetus, which affects herd productivity, particularly in breeding herds, by causing embryonic death, pyometra and sporadic abortions. In this thesis, two general objectives were established: to characterize the pathogenic profile and the molecular profile of T. foetus isolated from clinical samples of cattle belonging to different farming establishments in Buenos Aires province. For the study, a strain collection was established with 114 cryopreserved bovine isolates of T. foetus. The isolates were submitted from different laboratories in Buenos Aires province. From the established strain collection, 26 isolates from different lives tock regions of Buenos Aires province were chosen. The selected isolates were cloned to be studied as clones or strains and they were also confirmed by polymerase chain reaction (PCR). The optimization of the cloning technique allowed us to obtain strains from prime cultures and to characterize the colonies in solid media, observing that all the strains under study produced hemolysis of bovine red blood cells.The pathogenic profiles of T. foetusstrains were characterized by evaluation of the hemolytic activity, the production of subcutaneous abscessesin BALB/c mice, the cyto-adherence tomouse vaginal cells and CHO cells, the cytopathogenic effect (CPE) on CHO cells and the persistence of vaginal infection inBALB/c female mice.The results of hemolytic activity, cyto-adherence and CPEin the CHO cell line, allowed the categorization of T. foetusstrains. The establishmentof the vaginal infection in the mouse model and the evaluation of its persistence for 5 weeks, allowed the observation oflong persisting lesions in the reproductive tract.Molecular profiles were characterized by determination ofthe carbohydrate profile by lectin-cytochemistry, determination of the protein profile bySDS-PAGE, determination of the presence of the cysteine protease 8 (CP8) gene by PCR and determination of thegenetic polymorphism between strains by using molecular markers. Homogeneous protein profiles were observed by SDS-PAGE. The presence of the CP8 gene was confirmed in all the strains. By subsequent sequencing it was possible to verifythe absence of polymorphism both in the gene andin its promoter region. By lectin-cytochemistry it was determined the predominance of mannose, N-acetyl glucosamine and sialic acidin the studied strains. The results of the pathogenic and molecular characterization demonstrated variability between the T. foetuss trains studied. However, the molecular markers allowed the identification of two genotypes, defining a pathogenic pattern linked to CPE and hemolytic activity. The BL genotype, to which 21/26 strains belong, presented marked CPE and high hemolytic activity. The minority genotype B (5/26) corresponds to strains with less evident CPE in CHO cells and low hemolytic activity. Therefore, consideringall these results, we can conclude that the T. foetus strains obtained from clinical samples show differences in the variables linked to pathogenicity analyzed. Fil: Doumecq, María Laura. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Soto, Pedro. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina. Fil: Monteavaro, Cristina Esther. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias; Argentina.
Databáze: OpenAIRE
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