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The majority of skeletal elements are formed through endochondral ossification in which the signal molecule Indian hedgehog (Ihh) plays a key role. It regulates chondrocyte proliferation and differentiation and promotes osteoblast differentiation thus coordinating chondrogenesis with osteogenesis. In a previous study our group identified several candidate genes, which potentially act downstream of Ihh. In this study one of these genes, the transmembrane protein 16f (Tmem16f) was investigated in more detail and the skeletal phenotype of Tmem16f deficient mice was characterized. First, the Tmem16f gene was analyzed in silico and mapped to the mouse chromosome 15 (15F1) covering 184 kb of the genomic region. Tmem16f consists of 21 exons and encodes a protein of 911 amino acids. By performing 5´-RACE we have discovered that the second exon is alternatively spliced. Additionally a shorter isoform of Tmem16f named Ano6-202 was predicted by the Ensembl database. It represents the 3´-sequence of the long isoform (exons 13 to 21) and an alternatively spliced exon 12b on the 5’-end. Furthermore the in silico analysis predicted 8 transmembrane domains and six N-linked glycosylation sites for Tmem16f. Second, we defined an expression pattern of Tmem16f specifically in the developing bone and periosteum. In E14.5 and E16.5 wild-type mouse embryos Tmem16f is expressed by the osteoblasts of the forming bone and periosteum surrounding the Ihh expression domain. However, in mouse mutants, deficient for important regulators of bone development, such as Ihh, Runx2 or Osterix, the expression of Tmem16f was not detected, indicating that Tmem16f acts downstream of Ihh and the transcription factors Runx2 and Osx. Third, the transient transfection of COS7-cells with Tmem16f-GFP fusion construct demonstrated that Tmem16f is localized in the cytoplasm. The main focus of this study was to decipher the function of Tmem16f. Therefore a mouse line carrying a targeted deletion of the first exon of Tmem16f was generated. Additionally, we created a second mouse line carrying a gene trap cassette inserted into intron 13 of Tmem16f, which leads to disruption of both isoforms of Tmem16f. Analysis of the skeletal preparations of Tmem16f mutant embryos revealed that both transgenic mouse lines display the same phenotype. The endochondral and intramembranous ossification was markedly delayed, the long bones of limbs and ribs were shortened and curved compared to those of wild type embryos. The sutures between the skull bones were wider in mutant embryos than those of wild type embryos. At the age of 1 month the bones of Tmem16f mutant mice were slightly shorter and the olecranon processes of the ulna were smaller than those of the wild type mice. At this age, the long bones of the limbs and ribs were not bent any more as seen in the embryonic stage. However, the ulna and radius were twisted around each other in Tmem16f deficient mice. Analysis of endochondral ossification on the molecular level revealed that proliferation and differentiation of chondrocytes is not affected, whereas the ossification process is severely delayed. The expression of early osteoblast markers is unaffected in the periosteum, but reduced in the trabeculae. Later osteoblast differentiation is disturbed as shown by a delayed onset of mineralization and reduced Osteocalcin expression. These experiments indicate that Tmem16f is required for proper bone mineralization during embryogenesis but might have less important function in adult life. Die meisten Skelettelemente werden durch endochondrale Ossifikation gebildet. Das Signalmolekül Ihh spielt in diesem Prozess eine wichtige Rolle. Ihh reguliert die Proliferation und Differenzierung der Chondrozyten und die Differenzierung der Osteoblasten. Ihh koordiniert auf diese Weise die Chondrogenese mit der Osteogenese. In früheren Untersuchungen unserer Gruppe wurden verschiedene Kandidatengene identifiziert, die möglicherweise downstream von Ihh funktionieren. In der vorliegenden Arbeit wurde eines dieser Kandidatengene (Tmem16f) untersucht und der Skelettphänotyp der Tmem16f defizienten Mäusen charakterisiert. Zuerst, wurde das Tmem16f Gen in silico analysiert. Es liegt auf dem Mauschromosom 15 in der Bande 15F1. Der Genlokus erstreckt sich über 185 kb und umfasst 21 Exons. Tmem16f kodiert für ein Protein mit 911 AS. Durch 5‘-RACE wurde festgestellt, dass das zweite Exon alternativ gespliced wird. Des Weiteren wird von der von Ensembl Datenbank eine kurze Isoform vorausgesagt, die als Ano6-202 bezeichnet wird. Diese entspricht dem 3‘-Sequenzbereich der langen Isoform (Exon 13 bis 21) mit einem alternative gesplictem Exon 12b am 5‘-Ende. Weitere in silico Analysen sagen für das Tmem16f Protein acht Transmembrandomänen und sechs N-verknüpfte Glycosilierungsstellen voraus. Zweitens, wurde eine spezifische Genexpression von Tmem16f im sich entwickelten Knochen und im Periost nachgewiesen. In E 14,5 und E 16,5 Wildtyp Mäuseembryonen wird Tmem16f von Osteoblasten im sich entwickelnden Knochen und Periost neben der Ihh-Expressionsdomäne exprimiert. Da in Ihh-, Runx2- bzw. Osx- defizienten Mutanten keine Tmem16f Expression detektierbar ist, scheint Tmem16f downstream von Ihh, Runx2 und Osx zu agieren. Drittens, durch transfektion von einem Tmem16f-GFP Fusionskonstrukt in COS-7 Zellen konnte eine zytoplasmatische Lokalisation von Tmem16f nachgewiesen werden. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der funktionellen Untersuchung von Tmem16f. Hierzu wurden Mausmutanten, die eine Deletion des ersten Exons des Tmem16f-Gens tragen generiert. Außerdem wurde eine zweite Mauslinie kreiert, die eine Genetrapkassette im 13. Intron enthält, wodurch es zur Unterbrechung beider Tmem16f Isoformen kommt. Bei der Analyse von Skelettpräparationen der Tmem16f Mutantenembryonen wurde festgestellt, dass beide Mauslinien den gleichen Phänotyp, einer stark verzögerten Endochondralen und Desmalen Ossifikation zeigen Die Langknochen der Gliedmaßen und die Rippen der Tmem16f-Mausmutanten sind gebogen und verkürzt im Vergleich zu Wildtypmäusen. Die Schädelnähte sind bei den Mutanten breiter als bei den Wildtypembryonen. Bei 1 Monat alten Mausmutanten sind die Knochen etwas kürzer als bei Wildtypmäusen. Die Langknochen der Gliedmassen und die Rippen sind nicht mehr gebogen. Jedoch sind Ulna und Radius bei den Mausmutanten umeinander gedreht, während diese bei Wildtypenmäusen sind parallel verlaufen. Die Analyse der endochondrale Ossifikation auf molekularer Ebene zeigte, dass die Proliferation sowie die Differenzierung der Chondrozyten bei den Tmem16f-Mausmutanten unverändert, jedoch die Ossifikation stark verzögert ist. Die Expression der frühen Osteoblastmarkern ist im Periost unverändert, aber in den Knochenbälkchen reduziert. Durch den Nachweis einer verzögerten Mineralisierung und reduzierten Osteocalcin Expressions konnte gezeigt werden, dass die Differenzierung der späten Osteoblasten verlangsamt ist. Diese Untersuchungen zeigen, dass Tmem16f für die korrekte Knochenmineralisierung während der embryonal Entwicklung notwendig ist, jedoch bei adulten Tieren eine untergeordnete Rolle spielt. |
