| Popis: |
Metformin is a biguanide derivative widely used in the treatment of diabetes mellitus. Recent studies have shown the anticancer properties of metformin. The possible mechanisms of anticancer effects of metformin have not been fully elucidated. For this reason, interest in the effects on cell proliferation and apoptosis has increased in various human cancer cell lines and studies have been started. In this thesis, it is aimed to investigate cytotoxic, genotoxic and apoptotic effects of metformin on HepG2 and HeLa cell lines. Metformin in HepG2 cells did not produce a significant cytotoxic effect when compared to (-) control after 48 h incubation in the 0.5 - 2 mM concentration range; but at a concentration of 4 mM and above, there was a statistically significant decrease in cell viability in a dose-dependent manner. The IC50 value in the HepG2 cells was found to be 57.3 mM. In HeLa cells, metformin did not produce a significant cytotoxic effect when compared to (-) control after 48 h incubation in the concentration range of 0.5-16 mM; but cell viability decreased in a dose-dependent manner at concentrations of 32 and 64 mM which was statistically significant. The IC50 value in HeLa cells was found to be 76.9 mM. It was determined that when compared to (+) control all the concentrations of metformin (5-1000 μM) in the HepG2 and HeLa cells were statistically significantly reduced by the Comet method. Cell cycle analysis with HepG2 cells revealed a 10 % apoptosis in the cell population at a concentration of only 32 mM. Effect of metformin on cell cycle in HepG2 cells, increase in G0 / G1 phase accumulation was observed at 4, 8 and 64 mM concentrations compared to (-) control (80 %) and it was found higher compared with the (-) control of cell cycle (91 %, 99 %, 97 % respectively). Proliferation was observed in HepG2 cells. Cell cycle analysis with HeLa cells revealed apoptosis of 30 %, 39 %, 27 % in the cell population at 4, 32 and 64 mM concentrations, respectively. Our results have shown that it may reduce oxidative DNA damage in non-cytotoxic high doses of metformin and may lead to apoptosis, but further studies are needed to support these results. Hacettepe BAP İÇİNDEKİLER ONAY SAYFASI iii YAYIMLAMA VE FİKRİ MÜLKİYET HAKLARI BEYANI iv ETİK BEYAN SAYFASI v TEŞEKKÜR vi ÖZET vii. vii ABSTRACT viii İÇİNDEKİLER ix SİMGELER VE KISALTMALAR xi ŞEKİLLER xiii TABLOLAR xiv 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER 3 2.1. Prediyabet ve Diyabet Tanımı ve Sınıflandırılması 3 2.1.1. Tip 1 Diyabet 8 2.1.2. Tip 2 Diyabet 11 2.1.3. Gestasyonel Diyabet 12 2.1.4. Diyabetin Spesifik Türleri 13 2.2. Diyabet Tanı ve Tarama Testleri 15 2.2.1. Tip 1 Diyabet Taraması 15 2.2.2. Tip 2 Diyabet Taraması 15 2.2.3. Gestasyonel Diyabet Taraması 16 2.2.4. C Peptit Düzeyi 17 2.2.5. Adacık Otoantikorları 17 2.3. Diyabet Tedavisi 17 2.3.1.Eğitimi 17 2.3.2. Tıbbi Beslenme Tedavisi 17 2.3.3. Egzersiz 18 2.3.4. Medikal Tedaviler 18 2.4. Metformin 19 2.4.1. Metforminin Farmakokinetik Etkinliği 21 2.4.2. Metforminin Hücresel Alımı 22 2.4.3. Metformin ve Mitokondriyal Oksidatif Fosforilasyon 23 2.4.4. Metforminin Antineoplastik Etkinliği 24 2.5. Diyabet ve Kanser 26 2.5.1 Diyabet ve Hepatosellüler Karsinom 28 2.5.2 Diyabet ve Serviks Kanseri 28 x 2.6. Çalışmada Kullanılan Hücreler ve Özellikleri 28 3. GEREÇ VE YÖNTEM 31 3.1. Kullanılan Kimyasal Maddeler 31 3.2. Kullanılan Araç ve Gereçler 32 3.3. Çalışma Çözeltileri 33 3.4. Yöntemler 34 3.4.1. HepG2 ve HeLa Hücre Hatlarında MTT Yöntemi ile Sitotoksititenin Belirlenmesi 34 3.4.2. HepG2 ve HeLa Hücre Hatlarında COMET Yöntemi ile Genotoksisitenin Belirlenmesi 36 3.4.3. HepG2 ve HeLa Hücre Hatlarında Apoptotik Etkilerin Flow Sitometri Yöntemi ile Belirlenmesi 37 3.5. İstatistiksel Yöntemler 38 4. BULGULAR 39 4.1. Metformin Sitotoksititesinin MTT Yöntemi ile Belirlenmesi 39 4.1.1. HepG2 Hücrelerinde MTT Yöntemi ile Metformin Sitotoksisitesinin Belirlenmesine İlişkin Bulgular 39 4.1.2. HeLa Hücrelerinde MTT Yöntemi ile Metformin Sitotoksititesinin Belirlenmesine İlişkin Bulgular 40 4.2. Metformin Genotoksisitesinin COMET Yöntemi ile Belirlenmesi 42 4.2.1. Metforminin HepG2 Hücrelerinde 48 Saatlik İnkübasyon Süresi Sonundaki Genotoksisitesinin ve H2O2 ile İndüklenen DNA Hasarına Karşı Etkisinin COMET Yöntemi ile Belirlenmesine İlişkin Bulgular 42 4.2.2. Metforminin HeLa Hücrelerinde 48 Saatlik İnkübasyon Süresi Sonundaki Genotoksisitesinin ve H2O2 ile İndüklenen DNA Hasarına Karşı Etkisinin COMET Yöntemi ile Belirlenmesine İlişkin Bulgular 46 4.3. Metforminin Apoptotik Etkilerinin Flow Sitometri ile Belirlenmesi 49 4.3.1. Metforminin HepG2 Hücrelerindeki Apoptotik Etkilerinin Belirlenmesine İlişkin Bulgular 49 4.3.2. Metforminin HeLa Hücrelerindeki Apoptotik Etkilerinin Belirlenmesine İlişkin Bulgula 53 5. TARTIŞMA . 56 6. SONUÇ VE ÖNERİLER 62 7. KAYNAKLAR 63 8. ÖZGEÇMİŞ Metformin, diabetes mellitus tedavisinde yaygın olarak kullanılan bir biguanid türevidir. Son zamanlarda yapılan çalışmalarda metforminin antikanser özelliği gösterilmiştir. Metforminin olası antikanser etki mekanizmaları tam olarak açıklık kazanmamıştır. Bu sebeple çeşitli insan kanser hücre hatlarında, hücre çoğalması ve apoptoz üzerine etkilerine olan ilgi artmış ve bu konuda çalışmalar yapılmaya başlanmıştır. Bu tezde HepG2 ve HeLa hücre hatlarında metforminin sitotoksik, genotoksik ve apoptotik etkilerinin incelenmesi amaçlanmıştır. HepG2 hücrelerinde metforminin 48 saatlik inkübasyon sonrası 0,5-2 mM konsantrasyon aralığında (-) kontrol ile karşılaştırıldığında önemli bir sitotoksik etki oluşturmadığı; ancak 4 mM ve üzeri konsantrasyonlarda doz bağımlı olarak hücre canlılığını istatistiksel olarak anlamlı azalttığı görülmüştür. HepG2 hücrelerinde IC50 değeri 57,3 mM bulunmuştur. HeLa hücrelerinde metforminin 0,5-16 mM konsantrasyon aralığında 48 saatlik inkübasyon sonrası (-) kontrol ile karşılaştırıldığında önemli bir sitotoksik etki oluşturmadığı; ancak 32 ve 64 mM konsantrasyonlarında doz bağımlı olarak hücre canlılığını istatistiksel olarak anlamlı azalttığı görülmüştür. HeLa hücrelerinde IC50 değeri 76,9 mM bulunmuştur. Comet yöntemi ile değerlendirmede HepG2 ve HeLa hücrelerinde metforminin çalışılan tüm konsantrasyonlarında (5-1000 μM) (+) kontrolle kıyaslandığında DNA hasarını istatistiksel olarak anlamlı azalttığı belirlenmiştir. HepG2 hücreleri ile yapılan hücre siklusu analizinde hücre popülasyonunda sadece 32 mM konsantrasyonda % 10 oranında apoptoz gözlenmiştir. HepG2 hücrelerinde hücre siklusuna metforminin etkisi (-) kontrol ile kıyaslandığında 4, 8 ve 64 mM konsantrasyonlarda G0/G1 fazında birikimde artış gözlenmiş olup (-) kontrole (% 80) göre yüksek bulunmuştur (sırasıyla % 91, % 99, % 97). HepG2 hücrelerinde proliferasyon gözlenmiştir. HeLa hücreleri ile yapılan hücre siklusu analizinde hücre popülasyonunda 4, 32 ve 64 mM'lik konsantrasyonlarda sırasıyla % 30, % 39, % 27 oranında apoptoz gözlenmiştir. Çalışma sonuçları, metforminin sitotoksik olmayan yüksek dozlarında oksidatif DNA hasarını azaltabileceğini ve apoptoza yol açabileceğini göstermektedir, ancak bu sonuçların desteklenmesi için daha ileri çalışmalar gerekmektedir. |
