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Objetivo: O propósito deste estudo foi avaliar, in vitro, a eficácia de diferentes protocolos de medicação intracanal em canais radiculares infectados com Enterococcus faecalis. Métodos: Oitenta e oito incisivos bovinos foram contaminados com Enterococcus faecalis, permanecendo em cultura por 30 dias para a formação do biofilme. Os dentes foram divididos em dez grupos de acordo com a presença de penetração desinfetante, medicação intracanal utilizada e o local de colocação desta medicação: G1(CHX gel) clorexidina gel 2% (terço cervical), G2(CHX liq) clorexidina líquida 2% (terço cervical), G3(TC) tricresol formalina (entrada do canal); nestes grupos (n=10) não foi realizada penetração desinfetante com hipoclorito de sódio 2%. Seguindo, G4(DP+CHX gel) clorexidina gel 2% (todos os terços), G5(DP+CHX liq) clorexidina líquida 2% (todos os terços), G6(DP+TC) tricresol formalina (entrada do canal), G7(DP+Ca (OH)2) pasta de hidróxido de cálcio (todos os terços); nestes grupos (n=10) foi realizada penetração desinfetante com hipoclorito de sódio 2%. Seguindo, G8(DP NaOCl) penetração desinfetante com hipoclorito de sódio 2%, G9(DP H2O) penetração desinfetante com água destilada, G10(sem tratamento); estes grupos (n=6) foram considerados controles. Teste microbiológico (contagem de UFCs) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram realizados para avaliar e ilustrar respectivamente a eficácia dos tratamentos propostos. Análise estatística foi realizada através de ANOVA, seguido pelo post-hoc de Tukey (a =0. 05). Resultados: O teste microbiológico demonstrou que os grupos G4(DP+CHX gel), G5(DP+CHX liq), G6(DP+TC) e G7(DP+Ca(OH)2) não apresentaram crescimento bacteriano, sendo estatisticamente diferentes dos demais grupos (p |