| Popis: |
Cartilage degeneration is a pathology that develops over time, beginning with the softening of the cartilaginous gland and then completely disappearing. It may be due to trauma, as well as diseases such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis and obesity. Although it is not known exactly how the disease has begun, it is thought that genetic factors play a role likewise many diseases. In degenerative cartilage, most of the extracellular matrix content is degraded, which causes the joint cartilage to lose its elasticity, viscosity, lubrication and durability. The proposed thesis is designed for cartilage regeneration with hydrogels containing nanoparticles containing microRNAs that inhibit cartilage degradation. The hydrogels developed in the thesis were formed from methacrylated chondroitin sulphate and gelatin to mimic articular cartilage extracellular matrix and nanoparticles carrying microRNA 149-5p were formed with hyaluronic acid and chitosan, which are commonly used in cartilage degeneration treatments. With the optimizations performed, the hydrogels are formed into the injectable form and the physical and chemical characterization of the nanoparticles and hydrogels is completed. The ability of nanoparticles for gene transfection and the effect of hydrogel and nanoparticles on chondrogenesis were tested on human mesenchymal stem cells and demonstrated by cytotoxicity tests, proliferation analysis, cytological stainings and gene expression analysis. ÖZET ...................................................................................................................... i ABSTRACT ........................................................................................................... ii TEŞEKKÜR ............................................................................................................ iii İÇİNDEKİLER DİZİNİ ........................................................................................... iv ŞEKİLLER DİZİNİ ................................................................................................ viii ÇİZELGELER DİZİNİ...............................................................................................x SİMGELER ve KISALTMALAR .............................................................................. xi 1. GİRİŞ................................................................................................................. 1 2. GENEL BİLGİLER ............................................................................................. 3 2.1. Enjekte edilebilir hidrojeller ............................................................................. 3 2.1.1. Enjekte edilebilir hidrojellerde biyobozunur malzemeler .......................... 5 2.1.1.1. Doğal malzemeler ........................................................................... 5 2.1.1.2. Sentetik malzemeler ...................................................................... 7 2.1.2. Enjekte edilebilir hidrojellerin sentez mekanizmaları ............................... 8 2.1.2.1 Fiziksel çapraz bağlanma mekanizmaları ........................................ 8 2.1.2.2. Kimyasal çapraz bağlanma mekanizmaları................................... 10 2.1.3. Enjekte edilebilir hidrojel uygulamaları .................................................. 12 2.1.3.1. Kıkırdak onarımı ........................................................................... 12 2.1.3.2. Yumuşak doku rejenerasyonu ...................................................... 13 2.2. İlaç taşınım sistemleri ................................................................................... 13 2.2.1. Polisakkaritler ...................................................................................... 14 2.2.2.Polisakkarit nanopartiküllerin sentez mekanizmaları ............................ 15 2.2.2.1. Polielektrolit komleksi (PEC) ........................................................ 15 2.2.2.2.Kendiliğinden düzenlenme ............................................................. 16 2.2.2.3. Kovalent çapraz bağlanma .......................................................... 16 2.2.2.4. İyonik çapraz bağlanma ............................................................... 17 2.2.3. Polisakkarit bazlı nanopartiküller ......................................................... 18 2.2.3.1. Kitosan bazlı nanopartiküller ........................................................ 18 v 2.2.3.2. Heparin bazlı nanopartiküller ....................................................... 19 2.2.3.3. Hyaluronik asit bazlı nanopartiküller ............................................ 20 2.2.3.4. Aljinat bazlı nanopartiküller .......................................................... 22 2.2.3.5. Kondroitin sülfat bazlı nanopartiküller .......................................... 23 2.3. Artiküler kıkırdak............................................................................................ 24 2.3.1. Artiküler kıkırdak yapısı ve içeriği......................................................... 24 2.3.2. Kıkırdak dejenerasyonu ...................................................................... 25 2.3.3. Kıkırdak dejenerasyonu için uygulanan tedaviler ................................ 25 2.3.3.1. Mikrofraktür ................................................................................... 25 2.3.3.2. Otolog kondrosit implantasyonu (ACI) ......................................... 26 2.3.3.3. Doku iskelesi bazlı tedaviler.......................................................... 27 2.3.3.4. İntra-artiküler enjeksiyonlar ........................................................... 28 2.3.3.5. Platelet zengin plazma (PRP) tedavisi ......................................... 33 2.4. Gen terapisi ................................................................................................... 35 2.4.1. Mikro RNA............................................................................................ 41 3. DENEYSEL ÇALIŞMALAR.............................................................................. 42 3.1. Kondroitin sülfat metakrilat sentezi .............................................................. 42 3.2. Jelatin metakrilat sentezi ............................................................................. 42 3.3. CSMA ve GELMA hidrojellerinin sentezi ..................................................... 42 3.4. CSMA:GELMA hidrojellerinin reoloji deneyleri ............................................ 42 3.5. CSMA:GELMA hidrojellerin şişme deneyleri ............................................... 43 3.6. CSMA:GELMA hidrojellerinin degredasyon deneyleri ................................. 43 3.7. HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerin sentezlenmesi ......................... 43 3.8. HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerin stabilite deneyleri ..................... 44 3.9. HA/CS nanopartiküllerin mikro RNA-149-5p enkapsülasyonu...................... 44 3.10. Mikro RNA’nın yüklenme etkinliğinin belirlenmesi ve salım deneyleri .......45 3.11. Jel retardasyon deneyleri .......................................................................... 45 3.12. Sitotoksisite deneyleri ................................................................................ 45 3.13. Mikro RNA transfeksiyon deneyleri ............................................................ 46 3.13.1. RNA izolasyonu ........................................................................... 46 vi 3.13.2. cDNA sentezi ............................................................................... 47 3.13.3. Gerçek zamanlı PCR deneyleri..................................................... 48 3.14. Sitolojik boyamalar (sGAG boyamaları)...................................................... 49 3.15. İstatiksel analizler ....................................................................................... 50 4. BULGULAR VE TARTIŞMA ............................................................................ 51 4.1. CSMA ve GELMA yapılarının karakterizasyonu .......................................... 51 4.2. CSMA:GELMA hidrojellerinin karakterizasyonu .......................................... 63 4.2.1. CSMA:GELMA hidrojellerinin fiziksel karakterizasyonu ...................... 64 4.2.2. CSMA:GELMA hidrojellerinin reolojik incelemeleri............................... 65 4.2.3. CSMA:GELMA hidrojellerinin şişme ve degradasyon davranışlarının analizi ............................................................................................................ 68 4.2.4. CSMA:GELMA hidrojellerinin sitotoksisite analizleri............................. 71 4.3. HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin karakterizasyonları ................ 72 4.3.1. HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin stabilite testleri ............. 75 4.3.2. HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin sitotoksisite analizleri .... 76 4.3.3. HA/CS nanopartiküllerinin mikro RNA-149-5p ile etkileştirilme analizleri…………………………………………………………………………..... 77 4.3.4. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS nanopartiküllerinin mikro RNA salım profillerinin belirlenmesi ............................................................... 78 4.3.5. ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin mikro RNA-149-5p ile etkileştirilme analizleri......................................................................................................... 79 4.3.6. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin mikro RNA salım profillerinin belirlenmesi...................................................... 81 4.3.7. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartiküllerinin jel retardasyon analizleri .................................................. 82 4.4. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS nanopartikülleri katkılı 2:1 CSMA:GELMA hidrojellerinin karakterizasyonları ............................................... 83 4.5. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş ChoS (HA/CS) nanopartikülleriyle etkileştirilmiş hücrelerin gen ekspresyon analizleri .............................................. 84 4.6. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş ChoS (HA/CS) nanopartikülleri ile etkileştirilen hücrelerin sGAG boyamaları ........................................................... 88 4.7. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS nanopartikülleri ile bu partiküllerle katkılanmış 2:1 CSMA:GELMA hidrojelleriyle etkileştirilen hücrelerin gen ekspresyon analizleri ............................................................................................ 89 vii 4.8. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS nanopartikülleri ile bu partiküllerle katkılanmış 2:1 CSMA:GELMA hidrojelleriyle etkileştirilen hücrelerin sGAG boyamaları ............................................................................................................93 4.9. Mikro RNA-149-5p ile etkileştirilmiş HA/CS ve ChoS (HA/CS) nanopartikülleri ile etkileştirilmiş hücrelerin proliferasyon analizleri .............................................. 94 5. SONUÇLAR ve ÖNERİLER ............................................................................ 96 KAYNAKLAR...................................................................................................... 106 ÖZGEÇMİŞ ........................................................................................................ 137 Kıkırdak dejenerasyonu, kıkırdağın önce yumuşamasıyla başlayan, daha sonra tamamen yok olmasıyla sonuçlanan, zamanla gelişen bir rahatsızlıktır. Travmaya bağlı olabileceği gibi, osteoartirit, romatoid artirit, obezite gibi hastalıklar sonucunda da gelişmektedir. Hastalığın tam olarak nasıl başladığı bilinmemekle birlikte, bir çok hastalıkta olduğu gibi genetik faktörlerin rol oynadığı düşünülmektedir. Dejeneratif kıkırdakta dokunun hücre-dışı matris içeriğinin büyük kısmı degrade olmakta, bu da eklem kıkırdağının elastikliğini, viskozitesini, kayganlığını ve dayanıklılığını kaybetmesine neden olmaktadır. Önerilen tez, hali hazırda ağrı kesici terapiler dışında non-invazif tedavisi olmayan kıkırdak dejenerasyonunun, kıkırdak degradasyonunu engelleyecek mikro RNAlar barındıran nanopartiküller içeren hidrojeller ile tedavisi amaçlanarak tasarlanmıştır. Tezde geliştirilen hidrojeller artiküler kıkırdak hücre-dışı matrisi taklit etmek amacıyla metakrilatlanmış kondroitin sülfat ve jelatinden, mikro RNA 149-5p taşıyan nanopartiküller ise kıkırdak dejenerasyonu tedavilerinde sıkça kullanılan hyaluronik asit ve kitosandan oluşturulmuştur. Yapılan optimizasyonlarla hidrojeller enjekte edilebilir forma kavuşturulmuş, nanopartiküller ve hidrojellerin fiziksel ve kimyasal karakterizasyonları tamamlanmıştır. Nanopartiküllerin gen transfeksiyon başarısı ve hidrojel ve nanopartiküllerin kondrosit gelişimine etkisi insan mezenkimal kök hücreleri üzerinde test edilmiş, sitotoksisite, proliferasyon, sitolojik boyamalar ve gen ekspresyon analizleriyle gösterilmiştir. |
